1、ICS 6502001B 04中华人民共和国国家标准农业部1193号公告一32009转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT511及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived productsQualitative PCR method for insect-resistant rice TT51-1 and its derivates20090423发布 2009-0423实施中华人民共和国农业部发衣刖 置农业部1 193号公告一3-2009本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。本标准由全国农业转基因生
2、物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所、中国检验检疫科学研究院食品安全研究所、中国农业科学院生物技术研究所。本标准主要起草人：卢长明、沈平、武玉花、黄文胜、金芜军、祝长青。1范围农业部1 193号公告一3-2009转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT511及其衍生品种定性PCR方法本标准规定了转基因抗虫水稻TT5l_1转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因抗虫水稻TT51 1及其衍生品种，以及制品中TT51_1的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后
3、所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化农业部953号公告一6 2007转基因植物及其产品成分检测 抗虫转基因水稻定性PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1SPS基因SPS gene编码蔗糖磷合酸酶(Sucrose Phosphate Synthase)的基因。3 2Tr5卜1转化体特异性序列event-sp
4、ecific sequence of Tr5卜1TT51 1外源插入片段3端与水稻基因组的连接区序列，包括转化载体的部分序列和水稻基因组的部分序列。4原理根据转基因抗虫水稻TT5卜1转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得274 bp的预期DNA片段，判断样品中是否含有来源于转基因抗虫水稻TT511转化体的成分。5试剂和材料使用分析纯试剂和重蒸馏水。51琼脂糖。5 2 109L溴化乙锭溶液：称取10 g溴化乙锭(EB)，溶于100mI水中。注：澳化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。53 10molL氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠(NaOH)
5、8009，先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。农业部1 193号公告一3200954 500 mmolL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8o)：称取186 g乙二铵四乙酸二钠(EDTANa2)，加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液(53)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(53)调pH至80，加水定容至100 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。55 1 molL j羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH 8o)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tfis)溶解于800mL水中，用盐酸调pH至80，加水定容至l 000mL。在1034 kPa(121。C)
6、条件下灭菌20min。5 6 TE缓冲液(pH 8o)：分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，加水定容至1 ooo mL。在1034 kPa(121(2)条件下灭菌20 rain。5 7 50XTAE缓冲液：称取2422 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，先用300mL水加热搅拌溶解后，加入100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容到1 000 mL。使用时用水稀释成1XTAE。58加样缓冲液：称取2500 mg溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解12 h；称取2500 mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称
7、取500 g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4下保存。5 9 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bp1 000 bp的DNA片段。510 dNTPs混合溶液：将浓度为10 retoolL的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。511 优质热启动Taq DNA聚合酶(5 u”L)及PCR反应缓冲液。5 12引物。5 12 1 SPS基因SPS F1：5TTGCGCCTGAACGGATAT 3SPSR1：5一C黔AGAAGCACTGGACGAGG 3预期扩增片段大小为277 bp。5 12 2 Tr5卜1转化体特异性序列TT51
8、1 F 1 5AGCAGAACTTTAACCCCCfJ-AA 3TT511一R：5一AGAfiKTCGTTGGATTTCTTACAT一3预期扩增片段大小为274 bp。513引物溶液。用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10 pmolL。514 PCR产物回收试剂盒。6仪器6 1分析天平，感量1mg。6 2 PCR扩增仪：升降温速度15。Cs，孔间温度差异1，带有防蒸发热盖。63电泳槽、电泳仪等电泳装置。64紫外透射仪。6 5凝胶成像系统或照相系统。6 6重蒸馏水发生器或超纯水仪。6 7其他相关实验室仪器设备。7操作步骤71抽样2按NYT 672和NYT 673规定执行。72制样按NYT
9、672和NYT 673规定执行。7 3试样预处理按NYT 674规定执行。74 DNA模板制备按农业部953号公告一6 2007规定执行。7 5 PCR反应751试样PCR反应7 5 1 1每个试样PCR反应设置3次重复。7。512在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀。751，3将PCR管放人台式离心机中离心10 s后插人PCR仪中。751 4运行PCR反应。反应程序为：9CC变性2 rain；94。C变性30 s，56。C退火30 s，72。C延伸30 s，共进行35次循环；72延伸7 min。751 5反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1 PCR
10、反应体系试 剂 终浓度 体 积重蒸馏水 37 75I*L10PCR缓冲液 l 5uL25 retoolL氯化镁溶液 15mraolL 3 b(L10 retoolI，dNTPs混合溶液 02 ramolL 1，zI，10”toolI，上游引物 01 l,toolI 05 uL10“toolI下游引物 01 pmolL 0，5“L5106 UL Taq酶 25104 UL 025“L25 ragL DNA模板 1mg1， 20 vL总体积 50 uL洼l：如果10PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积重蒸馏水。注2：水稻内标准基因PCR检测反应体系中，上、F游引物分别为SPSF1和
11、SPSR1；TTSl1转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为TT5l_1一F和TT511一R。752对照PCR反应在试样PCR反应的同时。应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因水稻材料中提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以抗虫水稻TT511 DNA含量为011o的水稻DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板；空白对照中用重蒸馏水代替PCR反应体系模板。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与751相同。76 PCR产物电泳检测PCR产物用2琼脂糖凝胶电泳检测。按20 gL的浓度称取琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100
12、mI。琼脂糖溶液加入5 pL EB溶液，混匀，适当冷却后，将其倒入电泳板中，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7”I，PCR产物与3 pL加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 v5 Vcm条件下电泳。77凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照83农业部1 193号公告-3-2009的规定对PCR扩增结果进行分析。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的D
13、NA片段，按照78和79的规定执行。78 PeR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7，9 PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照检测结果分析阳性对照PCR反应中，SPS内标准基因和TT51_1转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出SPS基因片段，空白对照中除引物二聚体外没有其他扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。82样晶检测结果分析和表述a)SPS内标准基因和TT51 1转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出转基因抗虫水稻TT5卜1，表述为“样品中检测出来源于转基因抗虫水稻TT5卜1转化体的成分，检测结果为阳性”。b)SPS内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而TT511转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出转基因抗虫水稻TT51_1转化体，表述为“样品中未检测出来源于转基因抗虫水稻TT511转化体的成分，检测结果为阴性”。c)sPS内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出水稻成分，表述为“样品中未检测出水稻成分，检测结果为阴性”。
