1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部1163号公告一42009动物性食品中阿苯达唑及其标示物残留检测高效液相色谱法mgh performance liquid chromatographic method for thedeterminafion of Albendazole and its main metabolites residues inedible tissues of animal20090206发布 20090301实施中华人民共和国农业部发布刖 罱本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草
2、人：袁宗辉、陈冬梅、陶燕飞、范盛先、王玉莲、黄玲利、彭大鹏、刘振利、戴梦红。I农业部1 163号公告42009动物性食品中阿苯达唑及其标示物残留检测高效液相色谱法1范围本标准规定了动物可食性组织中阿苯达唑及其表示物阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑2一氨基砜残留检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪、鸡的肌肉、肝脏组织和牛奶中阿苯达唑及其表示物阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑2一氨基砜残留检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注E1期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方
3、研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3制样31样品的制备31 1取新鲜或冷冻空白或供试组织，去除筋膜，绞碎，5 000 rmin混匀。312取适量新鲜或冷冻空白供试牛奶样品。3 2样品的保存一18以下储存备用。4测定方法41方法提要或原理试料中残留的阿苯达唑及其标示物阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑2一氨基砜，经乙酸乙酯提取。正己烷去脂，固相萃取柱净化，用高效液相色谱仪紫外检测器测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合C；BT 6682规定的二级水。42 1
4、正己烷。42 2乙腈：色谱纯。4 23甲醇：色谱纯。4 2 4乙酸乙酯。4 2 5氢氧化钾。426 2，6一二叔丁基对甲酚。4 27冰乙酸。4 2 8无水硫酸钠。4 2 9盐酸。】农业部1 163号公告一4200942 10氨水。42 11乙酸铵。42 12阳离子交换固相萃取柱：60 rag3 mL。42 13阿苯达唑及代谢物标准品：阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑2一氨基砜含量均99。4 2 14阿苯达唑及代谢物标准储备液取阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑2一氨基砜标准品各100 mg，用甲醇溶解，并定容至100 mL，28保存，有效期1个月。4215阿苯达唑硬代谢物
5、标准工作液取阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑2氨基砜标准储备液，用流动相稀释成适当浓度的标准工作液，现配现用。42 16 50氢氧化钾溶液称取氢氧化钾50 g溶解于100mL水中，冷却至室温待用。4217 12。6一二叔丁基对甲酚溶液称取2，6一二叔丁基对甲酚10 g，乙酸乙酯稀释至100 mL，临用前配制。4218 01molL盐酸量取浓盐酸9 mL，加水稀释至1 000 mL。42 19 5氨化甲醇溶液量取氨水5 mI，甲醇稀释至100 mL，临用前配制。4220流动相A：002toolI乙酸铵缓冲液(pH 5)：称取乙酸铵154 g溶解于1 000 mL水中，加入冰乙酸05m
6、L，过022“m滤膜。B：甲醇。C：乙腈。4 3仪器和设备431高效液相色谱仪(配紫外检测器)。432分析天平感量0000 01 g，0001 g。433匀浆机。434离心机，5 000 rrain，10 000 rrain。4 35涡旋混合器。4 3 6固相萃取装置。437旋转蒸发仪。4 4测定步骤4 41试料的制备试料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料。44 2提取称取组织样品50 g，置于带盖离心管中，加入乙酸乙酯20 mL，氢氧化钾溶液01 mL，2，6二叔丁基对甲酚溶液1mL，涡旋混合5rain。加无水硫酸钠1 g，混匀，5 000 rml
7、n离心10rain。移取上清液于旋转蒸发瓶，重复提取一次，合并上清液，40。C旋转蒸发至干。用乙腈2mI。溶解残渣，混匀，超声5rain，2农业部1 163号公告一4-2009加盐酸溶液15mL，重复提取一次，合并上清液混匀，转移到10mL离心管。加正己烷5mL洗涤旋转蒸发瓶后转移到离心管中，混匀，静置分层，弃去上层正己烷层。下层加盐酸溶液3 mL，混匀。待净化。量取牛奶样品5 mL，置于带盖离心管中，加入乙酸乙酯6 mL，2，6一二叔丁基对甲酚溶液1 mL，旋涡混合5 min，5 000 rmin离心10 rain。移取上清液于离心管中，冉在试料中加乙酸乙酯6 mL重复提取一次，合并上清液，
8、40氮气吹干。用2mL乙腈超声5min溶解残渣，混匀，加盐酸溶液02mL，漩涡混匀。加正己烷5 mL，混匀，静置分层，弃去上层正己烷层。将下层乙腈层，于40氮气吹干。用流动相05 mL溶解残渣，10 000 rrain离心5 min，取上清液供高效液相色谱分析。4 43净化用甲醇6 mL和水6 mL活化固相萃取柱，将组织样品提取液过柱，控制流速小于2 mLmia。用盐酸溶液3mL，甲醇3mL淋洗，用氨化甲醇溶液6mL洗脱，收集洗脱液。在40。C45水浴条件下氮气吹干，用流动相05 mL溶解残渣，10 000 rmin离心5 min，取上清液供高效液相色谱分析。4 44标准曲线的绘制准确量取适量
9、阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑2氨基砜的标准储备液，用流动相配制成25 pgL、50pgI。、100 pgL、200肛gL、400tgL的混合标准系列工作液，依次进行测定，以得到的峰面积为纵坐标，对应的标液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。445测定4 4 51参考色谱条件a)色谱柱：C18柱，柱长250 rT1m，内径46 iTIIT；t，粒径5 pcm，或相当者；b)流动相梯度洗脱程序和流速见表1：表1梯度洗脱程序和流速时间 A B Cmln 000 80 5 151000 50 5 4515 00 10 5 852000 10 5 852500 80 5 15c)检测波长：2
10、92 11133；d)柱温：40；e)进样量：50 HL。4 4 5 2色谱测定在仪器最佳工作条件下，对阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑2一氨基砜药物的混合标准溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，混合标准溶液浓度为横坐标，绘制标准T作曲线。45空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。46结果计算和表述试料中阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑2氨基砜药物的残留量按式(1)计算： x一臀式中：x试料中阿苯达唑及其代谢物残留量，单位为微克每千克(ttgkg)A试样溶液中阿苯达唑及其代谢物的峰面积；农业部1 T63号公告42009Cs 标准工作液中阿苯达唑及其代谢物
11、的浓度，单位为微克每升(bigL)；v试样溶液体积，单位为毫升(mL)；A。 标准工作液中阿苯达唑及其代谢物的峰面积；w一 样品质量或体积，单位为克或毫升(g或mL)。5检测方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏度阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑2一氨基砜的检测限为10LgL，在猪、鸡肌肉组织中的定量限均为5肛gkg，在牛奶中的定量限均为5 pgL，在猪、鸡肝脏组织中的定量限均为10 pgkg。52准确度本方法在5,gkg250”gkg添加浓度时，回收率为70110。5 3精密度本方法的批间变异系数cv5。附录A(资料性附录)阿苯达唑及其代谢物高效液相色谱图农业部1 163号公告一42009图A 1 标准工作液色谱图(250 pgL)图A 2肌肉添加药物浓度为50略kg色谱图
