1、ICS 67040X 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一92008动物性食品中多拉菌素残留检测高效液相色谱法Determinafion of doramectin residue in animal derived foodHigh performance liquid chromatographic method20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 025号公告一92008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出和归口。本标准起草单位：中国农业大学动物医学院。本标准主要起草人：沈建忠、肖希龙、程林丽、江海洋、刘金凤、
2、李晓薇、曹兴元。本标准系首次发布的国家标准。1范围农业部1025号公告一92008动物性食品中多拉菌素残留检测高效液相色谱法本标准规定了动物性食品中多拉菌素残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于牛肝脏、牛肌肉、猪肝脏和猪肌肉组织中多拉菌素残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样3 1样品的制
3、备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。3 2样品的保存一20冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法原理或提要用乙腈提取试样中的多拉菌素，加水稀释，用三乙胺调节pH值，经C1s固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N甲基咪唑衍生化。以甲醇水为流动相，高效液相色谱一荧光检测法测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 21多拉菌素(Doramectin)纯度919。4 2 2甲醇色谱纯。423乙腈4 24三氟乙酸酐4 2 5三乙胺4 2 6异辛烷4 2 7 N一甲基咪唑4 2 8 C，。固相萃取柱50
4、0 rag6cc。429微孔滤膜4 2 10固相萃取柱洗涤液(乙腈-水一三乙胺。30+70+002vvV)1农业部1025号公告一92008取30mL乙腈、70mL水和20 pL三乙胺，混匀。4 2”N一甲基咪唑催化液取5 mL乙腈，加5 mL N一甲基咪唑混合均匀，4冰箱中密封避光保存，有效期1周。42 12三氟乙酸酐反应液取6 mI，乙腈，加12 mL三氟乙酸酐混匀，密封避光保存-临用现配。4 2 13多拉菌素标准贮备液(100p窖ITlL)称取多拉菌素对照品约10mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释定容，4下保存，有效期6个月。4 2 14多拉菌素标准贮备液(10 pgmL)取100
5、“gmL多拉菌素标准贮备液10 H1L于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，4条件下保存，有效期6个月。4 2 15多拉菌素标准工作液分别准确吸取一定量的10 pgmL多拉菌素标准贮备液，用甲醇稀释定容，制成浓度为1 ngmL、5 ngmL、10 ngmL、50 ngmL、100 ngmL和250 ngmL的标准工作液。4 3仪器和设备4 3 1高效液相色谱仪配荧光检测器。4 3 2组织匀浆机4 3 3离心机434天平感量001 g。4 35分析天平感量0000 01 g。4 3 6旋转蒸发仪4 3 7涡动仪4 3 8固相萃取装置439氮吹仪4310恒温箱4 4试料的制备试料的制备包括：取制
6、备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤4 5 1提取称取试样5 go05 g于50mL离心管中，加8mL乙腈，涡动lrain，3 500 rrain离心7rain，收集上清液。重复提取一次，合并两次上清液，加25mL水和50pL三乙胺，混匀，为上样溶液。4 5 2净化将c。固相萃取柱安装于固相萃取装置上，依次用5 mL乙腈和5 mL固相萃取柱洗涤液平衡，将上样溶液过柱，自然流干后抽真空5 rain，加3 mL异辛烷洗涤，抽真空5 min。5 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于5 mL刻度试管中，60。C
7、水浴条件下氮气吹至完全干燥，备用。2农业部1025号公告92008注：固相萃取上样液、淋洗液和洗脱液流速均不超过1 mLmln。4 5 3衍生化向试管中依次加200 ML N一甲基咪唑催化液和300 pL三氟乙酸酐反应液，密闭，涡动10 S，室温下衍生化反应15mln，加500止甲醇混匀，密闭，65。C下继续反应15rain。过02”“微孔滤膜，供高效液相色谱分析。454测定454 1色谱条件色谱柱：C，s柱，长250 mm，内径46 mm，粒径5m，或相当者。流动相：甲醇一水(97+3，vv)。流速：1 mEmin。柱温：30。激发波长；365 nm。发射波长：475 nnl。进样量：20
8、nL。4542测定法分别取适量衍生化后的试样液和标准工作液进行液相色谱测定，做单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中多拉菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样液测定过程中应参插标准工作液，以便准确定量。标准溶液和试样溶液的液相色谱图见图A1。4 6结果计算和表述动物组织中多拉菌素的含量x，以质量分数微克每千克(“gkg)表示，按式(1)计算：X一CV(1) m式中：c试样液中对应的多拉菌素的浓度，单位为微克每毫升(“gmL)；y溶解残留物所用流动相的体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法多拉菌素在动物组织中的检测限为06 pgkg，定量限为2o pgkg。52准确度本方法在1 pgkg500 pgkg添加浓度水平上的回收率为60120。53精密度本方法的批内变异系数15，批间变异系数20。农业部1025号公告一92008附录A(资料性附录)色谱图A 50 rigmL标准溶液B空白样品C 10 ngg空白添加样品图A 1 牛肝中多拉菌素残留测定色谱图
