1、ICS 67040X 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一222008动物源食品中4种硝基咪唑残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of four nitroimidazoles residues in edible tissues of animalLiquid chromatography-tandem mass spectrometry20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部1025号公告-22-2008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业大学、农业部兽药安全监督检
2、验测试中心(北京)。本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、丁双阳、夏曦、李晓薇、李建成、吴聪明、曹兴元。I农业部1025号公告一222008动物源食品中4种硝基咪唑残留检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物源食品中洛硝哒唑、甲硝唑、二甲硝唑及洛硝哒唑和二甲硝唑的代谢物2一羟甲基一1一甲基一5一硝基咪唑残罄量的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于猪肉、猪肝中洛硝哒唑、甲硝唑、二甲硝唑、2一羟甲基一卜甲基一5硝基咪唑残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励
3、根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法农牧发Ez003l号兽药残留试验技术规范(试行)农牧发199918号官方取样程序3原理组织样品经乙酸乙酯振荡提取、液液分配和固相萃取净化后，用液相色谱一串联质谱检测，外标法定量。4试剂除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯；水符合GBT 6682二级用水的规定。4 1正己烷：经重蒸馏。42乙酸乙酯：色谱纯。43乙腈：色谱纯。4 4甲醇：色谱纯。45盐酸。4 6盐酸溶液(o1 toolL)：量取83 mL盐酸(45)用水定容至1 000 mL。4 7
4、乙酸。4 8氨水。4 9固相萃取柱洗涤液：量取5mL甲醇(44)、1mL氨水(48)与44mL水混合，现配现用。410固相萃取柱洗脱液：量取15mL甲醇(44)、1mL氨水(48)与34mL永混合，现配现用。411洛硝哒唑、甲硝唑、二甲硝唑、2羟甲基一1一甲基一5一硝基咪唑标准物质：纯度99。412洛硝哒唑、甲硝唑、二甲硝唑、2一羟甲基一1一甲基一5一硝基咪唑标准储备溶液：01 mgmL。准确称取适量的每种硝基咪唑标准物质(411)，分别用乙腈配成01 mgmL的标准储备液，置一20冰箱中保存，有效期6个月。413硝基咪唑混合标准工作溶液：根据每种硝基咪唑的灵敏度和仪器线性范围，取储备液(41
5、2)配成1农业部1025号公告_222008不同浓度的混合标准工作溶液，4。C保存，有效期1个月。5仪器5 1液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52氮吹仪。53旋涡混合器。5 4离心机。5 5分析天平：感量001 g和0001 g。56旋转蒸发仪。57组织匀浆机。5 8固相萃取真空装置。59固相萃取柱Oasis MCX柱或相当者：60mg，3mL。6测定步骤6 1提取称取(5土o05)g试样，置于50mL离心管中，加15mL乙酸乙酯，加盖，涡动2min，4 000 rrain离心5 rain，分离后取有机相留用，残渣用15 mL乙酸乙醋同法处理。合并两次有机相，置100 niL鸡心瓶中，
6、40旋蒸至干。62净化向上述鸡心瓶中加入5 mL正己烷，涡动溶解残渣，转移至10 mL离心管中。再向鸡心瓶中加入3mL o1 toolL盐酸溶液(46)，涡动，与正己烷液合并于10 mL离心管中，手动振摇20次，3 000 rmin离心1 rain，弃去上层正己烷层。再加5 mL正己烷于鸡心瓶中，涡动后转移至含有01 toolL盐酸的离心管中，同法处理，将正己烷层去除干净，下层为备用液。MCX柱用2mL甲醇和2mL水预洗，备用液在重力作用下过柱，然后分别用2mL 01toolL盐酸(46)和1 mL固相萃取柱洗涤液(49)淋洗，在重力作用下流干。用2 mL固相萃取柱洗脱液(410)洗脱，真空抽
7、干。在洗脱液中加入30”L乙酸(47)，调pH至7o5，40。C水浴氮气吹干，用水定容至2mL，溶液过滤膜后，供液相色谱串联质谱仪测定。6 3液相色谱一串联质谱条件631 高效液相色谱一串联质谱法测定参数色谱柱：C8 150 mmX 21 mm，5 tLm或相当者。柱温：室温。进样量：10“L。流动相及流速见表l。表1液相色谱梯度洗脱条件时间 流速 水 乙腈Inlrl mLmin 0 0 O2 100 060 02 0 10080 02 0 100160 O2 100 02电离模式：电喷雾离子源。毛细管电压：3 V。离子源温度：80。脱溶剂温度：300。脱溶剂气流速：440 Lh。采集方式：多
8、反应监测(MRM)。Q1、Q3均为单位分辨率。定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。农业部1 025号公告22-2008表2 4种硝基咪唑的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量名称v eV洛硝哒唑 201140 20l140 20 1120155 23甲硝唑 172128 172128 22 1617282 21二甲硝唑 14296 14296 19 1814281 272一羟甲基一1一甲 158140 158140 1524基一5硝基咪唑 15855 1863 2测定取空白试样按提取与净化(61和62)进行处理，在洗脱液中加入相应的
9、标准溶液，氮吹、定容后作为基质标准溶液，将供试试样和添加试样与之比较作单点校正定量。通过样品总离子流图的保留时间和各色谱峰对应的特征离子，与标准品相应的保留时间和各色谱峰对应的特征离子进行对照定性。样品与标准品保留时间的相对偏差不大于5。样品的特征离子相对强度不超过标准品的特征离子相对强度平均值的20。64结果计算组织中硝基咪唑的残留量x，以质量分数(“gkg)表示，按公式(1)计算：X一丛皇卫(1) m式中：A试样特征离子峰面积与基质标准溶液特征离子峰面积比值对应硝基咪唑药物质量，单位为微克(“g)；，_一试样稀释倍数；m试样的取样量，单位为克(g)；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定
10、的算术平均值表示，保留至小数点后2位。7方法的灵敏度、准确度、精密度71灵敏度方法检测限：甲硝唑、2一羟甲基一1一甲基一5一硝基咪唑为05,gkg；洛硝哒唑、二甲硝唑为03旭kg。72准确度方法的回收率范围为60120。73精密度本方法的批内变异系数CV21，批间变异系数CV32。3农业部1 025号公告一222008附录A(资料性附录)RN乙洛硝哒唑MNZ甲硝唑DMZ二甲硝唑HMMNl2一羟甲基1一甲基一5一硝基咪唑图A1猪肝中硝基咪唑基质标准溶液总离子流图ES+C171ES+TIC2854RNZ洛硝哒唑MNZ甲硝唑DMZ二甲硝唑HMMNI2一羟甲基一1一甲基一5一硝基眯唑圈A2空白猪肝总离
11、子流图农业部1025号公告一222008660 670 6 80 690 700 710 7 20 730 7 40 7 50 7 60 7 70 7 80 7 90 8 00 810 8 20 8 30 840RN五洛硝哒唑MNZ甲硝唑DMZ二甲硝唑HMMNI2羟甲基一1一甲基5一硝基咪唑图A3猪肝中添加10 pgkg硝基咪唑的总离子流图6 60 6 70 680 690 7 oo 7 lO 720 730 740 750 7 60 770 7 80 790 8 oo 810 820 830 840 8 50RNL洛硝哒唑MNZ甲硝唑DMZ二甲硝唑HMMNI2一羟甲基一卜甲基一5一硝基咪唑图A 4猪肉中硝基咪唑基质标准溶液总离子流图5农业部102G号公告一22-2008RNZ洛硝哒唑MNZ甲硝唑DMZ二甲硝唑HMMNl2一羟甲基l_甲基5硝基眯唑图A 5空白猪肉总离子流图ES+TIC713ES+nC505ES+11C260ES+C60266 60 6 70 6 80 6 90 7 00 710 7 20 7 30 740 7 50 7 60 7 70 7 80 790电加810 820 8 30 8柏RNZ洛硝哒畦MNZ甲硝唑DMZ=甲硝矬HMMNI，2一羟甲基一l-甲基一5一硝基咪唑图A 6猪肉中添加1 0pgkg硝基咪唑总离子流图二
