1、GB/T 541 3. 19一1997前言本标准等同采用美国公职分析化学师协会(AOAC)方法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85。本标准由中国轻工总会提出.本标准由全国乳晶标准化中心归口。本标准负责起草单位g国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位s卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国)投资服务有限公司.本标准主要起草人z张玉杰、王芸、杨金宝.300 中华人民共和国国东标准婴幼儿配方食品和乳粉游离生物素的测定G8/T 5413.19-1997 Mllk powder and formula foods ror inCant and
2、 young chlldren Determlnatlon oC Cree biotln content 1 范围本标准规定了用微生物法测定游离生物素的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中游离生物素的测定。2 方法原理代替GB5413-85 通过植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)生长情况来测定游离生物素含量.3 试剂、菌种和培基所有试剂，如未注明规格，均指分析纯g所有实验用水.如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 生物素z标准品。3.2 乙醇z体积分数为50%。3. 3 菌种g植物乳杆菌(Lactobacillus户lantorum)1 3.4 培养基3.4. 1
3、 乳酸杆菌琼脂培养基g光解陈l蚀，酵母浸膏拢，葡萄糖1饨，番茄汁100mL.磷酸二氧僻始，聚山梨糖单油酸黯19.琼脂10g.蒸馆水1000mL，pH6.8土0.2(25C)。3.4.2 乳酸杆菌肉汤培养基g光解陈15g.酵母浸膏拢，葡萄糖1饨，番茄汁100mL.磷酸二氢饵句，聚山梨糖单泊酸醋1日，蒸馆水1000mL.pH6. 8土0.2(25C)。3.4.3 生物蒙测定用培养基z维生素测定用酶蛋白氨基酸12g.葡萄糖49g.乙酸纳2饨.L-肮氨酸O.2g.DL-色氨酸O.2g.硫酸腺瞟岭20mg.盐酸鸟嗦岭20mg.尿嘈咙20mg.盐酸硫胶素2mg.核黄素2mg，烟酸2mg.泛酸钙2mg.盐酸
4、毗哆醇2mg.p-氨基苯甲酸200g，磷酸氨二御19.磷酸二氢饵19.硫酸镑。-句，氯化纳20mg，硫酸亚铁20mg.硫酸锺20mg.加蒸饱水至1000mL.pH6. 7士0.1(25C)。4仪器常用微生物实验室仪器及pH计。5制备5. 1 菌种的制备5. 1. 1 液体培养基的制备吸取定量的基础液体培养基，加入等量的蒸铺水，每个培养管分装10mL.盖上盖.121C灭菌15mino迅速将灭菌管冷却，避免颜色形成。贮于冰箱中。吕京技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施30 GB/T 5413.19-1997 5. 1. 2 植物乳杆菌(Laclobacillus户lanlar
5、um)贮备管的制备将所用的微生物菌种接种到2个以上琼脂培养基试管内，在28-40C之间选择一个恒定温度(土0.5C)培养6-24h，完成后放入冰箱。在使用新的菌种用于一个测定时，要在1-2周内做几个继代转接。不要用保存一周以上的培养基接种，培养基在保存过程中不要打开。5. 1. 3 接种的准备将植物乳杆菌(Laclobacillusplanlarum) (3.3)转接到一个无菌的10mL液体培养基中，得到一个菌悬液。5.2 标准溶液的制备5.2. 1 生物素标准贮备液g浓度50g/mL。精确称取50-60mg生物素标祥(3.1) (从干燥器中)，用乙醇(3.2)稀释，得到Ij50月/mL的生物
6、素溶液，贮于冰箱中。5.2.2 生物素标准工作液.浓度。.lng/mL。吸lmL标准贮备液(5.2.1)，用水稀释到1000mL，再分别吸此稀释溶液各lmL，一个稀释到500mL，作为高浓度标准溶液，一个稀释到1000mL.作为低浓度标准溶液。每次现用现配。5.3 玻璃仪器的准备使用焰状活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗(月桂磺酸销，是一种合适的清洗剂检验微生物对少数生长因子和许多清洗剂具有很高的敏感性，因此，清洗之后要求在250C干热条件下，加热1-2h。6操作步骤6. 1 佯品的处理6. 1. 1 干粉样品精确称取一定量样品，该样品应含0.2-0.5mg生物素。继续6.1.
7、3步骤。6. 1. 2 液体样品吸一定量的液体样品，该样品应含0.2-0.5mg生物素。继续6.1.3步骤。6. 1. 3 样品的提取加水，使样品总体积为150mL，混合后，用lmol/L盐酸调pH为4.5-4.6，定量转型IJ250mL容量瓶中，用水定容，充分混合，用滤纸过滤，弃去最初的几毫升，吸5mL滤液，用水定容到100mL6.2 标准曲线的制备按表l顺序加入蒸馆水、标准溶液和维生素B12测定用培养基于培养管中，一式三份。表1试管号No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 蒸馆水.ml5 5 4 3 2 1 。2 l 。标准溶液1，mL。l 2 3 4 5 3 4 5 培养基，mL
8、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 j)试管No.3-7中加低浓度标准溶液，No.8-10中加高浓度标准溶液。6.3 测定液按表2顺序加蒸馆水、样品溶液和维生素B12测定用培养基于培养管内，一式三份。302 GB/T 541 3. 19一1997表2试管号No1 2 3 4 蒸铺水.mL4 3 2 1 样品，mLl 2 3 4 培养基.mL5 5 5 5 6.4 灭菌直接灭菌所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入循环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制冷条件均匀(灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响).121 c灭菌10min.6. 5接种无菌地接种每个管，均加入一滴适当的接
9、种物。除二组(或三组)中含有O.OmL标准溶液(未接种空白管)以外。盖上盖，充分振荡混合所有管。6.6培养在2840C之间选择一个恒定温度(士O.5 C ) .培养6072h。6. 7 测定(酸度法)试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查，进行反应预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。6. 7. 1 滴定用澳麟香草盼蓝作指示剂，用。.Imol/L氢氧化纳滴定每个管中溶液，或以pH6.8为电位滴定终点。如果接种空臼滴定反应等于或高于未接种空臼水平的1.5mL.则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.0mL的反应等于O.lmol/L氢氧化纳812mL的滴定度。6.7.2测pH值试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应预测，未接种管是滑的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。在培养之后读出管内容物的pH值，近似到O.OlpH值单位。7 分析结果寝述X F 样品中生物素的含量(g/100g或阅/loomL)=-xrtX100. ( 1 ) m !tllJlJ 式中，X每毫升测定溶液中生物素含量的平均值，m!.;F稀释因子zm-样品的质量或体积，g或mL.8 允许差同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。303
