1、GB/T 5413. 14-1997 前言本标准等效采用美国公职分析化学师协会(AOAC)方法，方法准确、灵敏度高.本系列标准从实施之日起，代替GB5413-850 本标准由中国轻工总会提出。本标准由全国轧品标准化中心归口.本标准负责起草单f.Il.:国家乳制品质量监督检验中心.本标准参加起草单位z卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国投资服务有限公司。本标准主要起草人z张玉杰、王芸、殷晓红、吕为群.277 中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉维生素B12的测定Mllk powd町andformllla f例dsfor infant and yO
2、llng children Determlnatlon of叶tamin8,2 tontent 1 范围本标准规定了用微生物法测定维生素B12的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B12的测定G2 方法原理GB/T 5413.14-1997 代替GB5413-85 莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusleichmannii)对维生素B12的存在具有极高灵敏性。利用这种特异性可定量测出样品中维生素B12的含量。3 试剂、菌种和培弊基所有试剂，如未注明规格，均指分析纯g所有实验用水，如未注明其他要求.均指三级水。3. 1 生理盐水，9g/L。3.2 乙醇.体积分数为25%。3.3
3、 无水磷酸氢二锅。3. 4 元水偏重亚硫酸锅。3.5 拧橡酸含一个结晶水)，3.6 菌种z莱土曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusleichma阳的。3.7 培养基。3.7.1 乳酸杆菌琼脂培养基z光解陈15g，酵母浸膏性，葡萄糖1饨，番茄汁100mL，磷酸二氢梆句，聚山梨糖单油酸酶Ig，琼脂10g，蒸馆水1000mL，pH6.8:J: O. 2(25C)。3. 7. 2 乳酸杆商肉汤培养基z光解豚15g，酵母浸膏蚀，葡萄糖1饨，番茄汁100mL，磷酸二氢梆2g，聚山梨糖单油酸醋Ig，蒸馆水1000mL,pH6. 8士O.2(25C)。3.7.3 维生素B12测定用培养基s无维生素酸水解酶
4、蛋白15g，葡萄糖40g，天门冬酸胶O.句，拧橡酸销20g，抗坏血酸旬，L胧氨酸。.4日，DL色氨酸。旬，硫酸腺瞟岭20mg，盐酸鸟瞟岭20mg，尿嘈晓20mg，黄嗦岭20mg，核黄素lmg，盐酸硫胶素lmg，生物素10问，烟酸2mg，p-氨基苯甲酸2mg，泛酸钙lmg，盐酸毗哆醇4mgf盐酸毗哆醒4mg，盐酸毗哆胶800阅，叶酸200吨，磷酸二氢御Ig，磷酸氢二御Ig，硫酸馁。.4mg，氯化纳20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锺20mg，聚山梨糖单油酸酶泣，蒸馆水IOOOmL，pH6.0士0.2(25C)。3. 8 维生素B12:标准品.国京技术撞督局1997-05-28批准1998-09-0
5、1 ;lt施278 4 仪器常用实验室仪器及z分光光度计。5制备5. 1 菌种的制备GB/T 5413. 14一1997 5. 1. 1 将保存在直柱状乳酸杆菌琼脂培养基中的莱士曼氏乳酸杆菌接种到新的培养基中。培养后再转接次，然后再将其从团体培养基上转接到乳酸杆菌肉汤培养基中培养。5. 1. 2 将乳酸杆菌肉汤中的培养液以2000r/min离心2-3min，倾出上清液，加入10mL生理盐水(3.1).搅匀，再离心2-3min，如此清洗34次，吸0.4mL该菌悬液于10mL盐水(3.1)中，待测。5.1.3 用分光光度计，以生理盐水(3.1)做空白，于550nm波长下测5.1.2中菌悬液的透光率
6、，此时应在60%80%之间。5.2 标准溶液的制备5.2.1 维生素B标准贮备液，浓度为100ng/mL.精确称取维生素B标准品，用乙醇(3.2)定容到维生素B浓度为100ng/mL.5.2.2维生素B中间贮备液，浓度为1ng/mL.用乙醇(3.2)将10mL标准贮备液(5.2.1)定容至1000mL.5.2.3 标准工作液，分二个浓度z高浓度牛一维生素BI2的浓度为0.02ng/mL，低浓度二维生素Bl2的浓度为O.Olng/mL.从中间液中(5.2.2)吸二个5mL.用蒸馆水分别定容到250mL和500mL。6操作步骤6. 1 样品的处理6. 1. 1 元水磷酸氢工纳(3.3)1.枪，无水
7、偏重亚硫酸锅(3.4)1.饨，拧糠酸含个结晶水)(3.5)1.2g.用100mL蒸馆水溶解。6. 1.2 称一定量的样品(约含维生素B1250100ng).用10mL的上述溶液(6.1.1)混合后，再加150mL蒸馆水，于121C水解1Omin，冷却后调pH至4.5.再用蒸馆水稀释，使最终溶液中维生素Bl2的质量浓度约在O.01 O. 02ng/mL.偏重亚硫酸销的质量浓度小于0.03mg/mL。6. 2 标准曲线的制备按袭I顺序加入蒸馆水、标准溶液和维生素BI2测定用培养基于培养管中，一式三份。表1试管号No.l 2 3 4 5 6 7 8 9 燕馆水.mL5 5 4 3 2 1 。2 1
8、。标准溶液J).mL 。l 2 3 4 5 3 4 5 培养基.mL5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1)试管No.37中加低浓度标准溶液INo.8-10中加高浓度标准溶液.6.3 测定液按表2顺序加蒸馆水、样品溶液和维生素BIZ测定用培养基于培养管内，一式三份。279 GB/T 5413.14-1997 表2试管号No.1 2 3 4 蒸惰水，mL4 3 2 l 样晶，mLl 2 3 4 培养蓦，mL5 5 5 5 6.4 接种将6.2和6.3中所有的试管于121c灭菌5min，然后迅速冷却。将6.1.2中的菌悬液用毛细滴管向上述试管中各加1滴其中标准曲线管中No.1除外)，混匀，3TC土0.5C培养1920h。6.5 测定以接种空白管做对照，测最高浓度标准样管的T，二个小时后重新读数，二次结果T值;2%，则取出全部检验管测其T，并记录。7分析结果的寝述以标样含维生素B的量为横坐标，T值为纵坐标做工作曲线。根据样品测得的T值，从标准曲线中查得维生素B含量的平均值，再根据式(1)计算每百克(或毫升样品中的实际含量2样品中维生素叫地/100g(mL) =云XT击oX 100 式中x一一从曲线中查得样品中维生素B的平均含量，ng;F一稀释因子e用一一样品的质量(或体积)，以或mL)。8 允许磐同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。 280 ( 1 )
