1、ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 28974-2012 马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法Detection and identification of potato virus A-Nanop缸1icles-enlargedin colloidal gold immunochromatographic assay 2012-12皿31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2013-06-01实施发布GB/T 28974-2012 .LL. 目U=i 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本
2、标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本标准主要起草人:邹明强、张帆、李锦丰、陈艳、戴华、田世民、马吉湘、金涌。I GB/T 28974-2012 sl 本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围元任何立场。该专利持有人己向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方
3、式获得:该专利持有人:中国检验检疫科学研究院联系人:邹明强地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号中国检验检疫科学研究院邮编:100123请注意除上述专利外，本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。E 1 范围马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法GB/T 28974-2012 本标准规定了用纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法检测马铃薯A病毒的原理、实验步骤及结果判定等。本标准适用于植物及其产品组织中马铃薯A病毒的快速筛查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其
4、最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 23629-2009 引进植物病原生物安全控制技术要求GB/T 23632-2009 进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程3 马铃薯A病毒基本信息中文名:马铃薯A病毒学名:potato virus A 缩写:PVA分类地位z马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。马铃薯A病毒的其他信息参见附录A。4 方法原理基于肢体金免疫层析双抗体夹心检测法原理，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规肢体金免疫层析试纸条进行处理，提高检测灵敏度，根据试纸条颜色的变化，判定待测
5、样品中是否存在马铃薯A病毒。5 仪器设备、用具及试剂材料5. 1 仪器设备天平(感量，1/10000 g)、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。5.2 用具微量移液器(2.5L、10L、20L、100L、200L、1000L)、研钵、离心管等。1 GB/T 28974-2012 5.3 试剂材料纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法测定马铃薯A病毒试剂材料(见附录B)。6 实验步骤3次，每次1min，然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加入30L增敏试剂，室温反应5min8 min后，观察检测线条带颜色。6.4.4 结果判定检测线条带出现颜色，判定为阳性;检测线条带不出现颜色，判定为阴性。注:增敏前条带颜色为红色
6、，增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。7 结果的确认可疑阳性样品应采用马铃薯A病毒RT-PCR检测方法进行确认。2 庐GB/T 28974-2012 8 样品的保存与复核种子类样品保存6个月，如果发现带毒样品保存1年。植株中发现病毒的，采集病叶干燥后保存于一20.C条件。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。军核程序按照GB/T23632-2009中第6章进行操作。/ / , 、飞、二二飞- 飞l/ / / / 乒xi7乒3 GB/T 28974-2012 附录A(资料性附录)马铃喜A病毒相关资料A.1 寄主范围马铃薯A病毒的自然寄主为马铃薯(Sola
7、numtuberosum) ;人工接种可侵染的植物(包括鉴别寄主)为番茄CLycopersiconesculentum和L.piminellifolium)、假酸浆CNicandraphysaloides)、烟草CNicotiana debneyi、N.glauca、N.glutinosa、N.sanderae、N.sylverstris、N.tabacum cv. Samsun和N. tabacum cv. White Burley)、Solanumdem issum X S. tuberosum cv. Aquila (= A6 hybrid)、S.demis sumSdA和Daturam
8、eteloides 0 A.2 病害症状多数马铃薯受该病毒侵染元明显症状，有的品种表现出轻型花叶、脉间叶组织凸起呈榴皱状、叶脉或叶脉间呈现不规则浅色斑及叶缘呈波状等症状。A.3 分布地区马铃薯A病毒分布于很多马铃薯重要产区，可存在于种薯、组培苗中，在欧洲各国、日本、美国、新西兰以及中国的福建、黑龙江、云南等地均有分布。A.4 传播方式该病毒可通过汁液、种薯及介体蜻虫CAhisfra吨ulae, A. nasturtii、Macrosihonsolaifolu、Myzus persicae及Neomyzuscirumflexus等)传播。4 GB/T 28974-2012 附录B(规范性附录)剖
9、米颗粒增敏肢体金免瘟层析法测定马铃薯A病毒试剂材料B. 1 肢体金免疲层析增敏快速检测试纸条样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标马铃薯A病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片，免疫金释放时间小于5min，释放效率大于80%;硝酸纤维素膜的检测线上包被了马铃薯A病毒多克隆抗体;质控线上包被了1mg/mL的羊抗鼠IgG;吸水垫为吸水纸。其结构见图B.L 样品流动方向样品垫u 吗惑。一品激础咄爱i tm L二检测线硝酸纤维素膜| 质控线吸水垫结合垫V L豆工?主叫舍白?部将格税豁疆h PVC背衬F 其中:玻璃纤维素片:吸水速率大于4s/cm，吸水量大于50rng/crn2 ; 硝酸纤维素膜CNC膜):毛细
10、流动速率大于25s/cm; 吸水纸z吸水速率大于3s/cm，吸水量大于100rng/crn2 ; 聚氯乙烯CPVC)板:初粘力大于或等于3号球，持粘力标准条件下大于80h. 圄B.1肢体金免瘟层析增敏快速检测试纸条B.2 样品提取缓冲液PBST 亚硫酸铀(Na2S03)PVP(MW24 00040 000) 叠氮铀(NaN3)4 C储存。lL 1. 3g 20 g 0.2 g B.3 PBST缓冲灌(洗涤缓冲液pH7. 4) 氯化铀(NaCD8g 5 GB/T 28974-2012 磷酸氢二铀(NazHP04)磷酸二氢梆(KHzP04)氯化饵(KCl)吐温-20蒸馆水定容至1L. B.4 增敏
11、试剂1. 15 g 0.2 g 0.2 g 0.5 mL 将1%的氯金酸和10mmol/L的盐酸楚腊按1: 5的体积比混合，混合后5min内使用。B.5 阴性对照取1g的一20.C下保存的健康叶片组织，用研钵液氮研磨粉碎，加入2mL样品提取缓冲液，4.C离心10min (3 000 g5 000 g)，取上清液制备成阴性对照。B.6 阳性对照取1g的一20.C下保存的灭活的病叶组织，用研钵液氮研磨粉碎，加入2mL样品提取缓冲液，4.C离心10min (3 000 g5 000 g)，取上清液制备成阳性对照。6 唱k气 . 3电;r N-ON|叮hNH目。嘈-, 华人民共和国家标准马铃薯A病毒检
12、疫鉴定方法纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法GB/T 28974-2012 国由咱a a、* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张o.75 字数12千字2013年4月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年4月第一版* 书号:155066. 1-46400定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28974-2012 打印日期:2013年4月23日F002
