1、号昌ICS 65.020.01 B 16 和国国家标准主七.、中华人民GB/T 28973-2012 番茄环斑病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法Detection and identification of tomato ring spot virus-Nanoparticles-enlarged in colloidal gold immunochromatographic assay 2013-06-01实施2012-12-31发布, 喃发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会二吵川, GB/T 28973一2012前言本标准按照GB/T1. 1-200
2、9给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本标准主要起草人:邹明强、李锦丰、张永江、陈艳、戴华、马吉湘、田世民。I G/T 28973-2012 sl -一一同本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围元任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明己在本文件的发布机构备案。相关
3、信息可以通过以下联系方式获得:该专利持有人z中国检验检疫科学研究院联系人:邹明强地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号中国检验检疫科学研究院邮编:100123请注意除上述专利外，本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。E 1 范围番茄环斑病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法GB/T 28973-2012 本标准规定了用纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法检测番茄环斑病毒的原理、实验步骤及结果判定等。本标准适用于植物及其产品组织中番茄环斑病毒的快速筛查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是
4、不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 23629一2009引进植物病原生物安全控制技术要求GB/T 23632一2009进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程3 番茄环斑病毒基本信息中文名:番茄环斑病毒学名:tomato ringspot virus 缩写:ToRSV 分类地位:虹豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Neovirus)。番茄环斑病毒的其他信息参见附录A。4 方法原理基于肢体金免疫层析双抗体夹心检测法原理，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规肢体金免疫层析试纸条进行处理，提高检测
5、灵敏度，根据试纸条颜色的变化，判定待测样品中是否存在番茄环斑病毒。5 仪器设备、用具及试剂材料5. 1 仪器设备天平(感量，1/10000 g)、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。5.2 用具微量移液器(2.5L、10L、20L、100L、200L、1000L)、研钵、离心管等。GB/T 28973-2012 5.3 试剂材料纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法测定番茄环斑病毒试剂材料(见附录B)。6 实验步骤6. 1 生物安全与废弃物处理实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照GB/T 23629-2009中5.7进行处理。离心 # , 入、h，若需长期保存，应量
6、-1(Q.C以下，避免反复冻融。6.4 病毒检测 6.4.1 检测步骤/ / 中分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各lbNU每个试验同时做孚行。室温放置15向in，观察检测线7772斗/ / / 测结果有效。如果质控线条带不出现颜色，或阳性对照检测线条带不出现颜色，或阴性对照检测线条带出现颜色6. 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加入100严L的PBST缓冲溶液进行清洗，反复清洗3次，每次1min，然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加入30L增敏试剂，室温反应5min8 min后，观察检测线条带颜色。6.4.4 结果判定检测线条带出现颜色，判定为阳性E检测线条带不出现颜色，判定为阴性。注
7、z增敏前条带颜色为红色，增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。7 结果的确认可疑阳性样品应采用番茄环斑病毒RT-PCR检测方法进行确认。2 飞唱. GB/T 28973-2012 8 样晶的保存与复核种子类样品保存6个月，如果发现带毒样品保存1年。植株中发现病毒的，采集病叶干燥后保存于一20c条件。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。复核程序按照GB/T23632-2009中第6章进行操作。/-/- / / 飞 飞 飞 3 GB/T 28973-2012 附录A(资料性附录)番茄环斑病毒相关资料A.1 寄主范围ToRSV的自然寄主有天堂葵属CPelar
8、goniumspp. )、悬钩子属CRubusspp. )、李属CPrumsspp. ) 和烟草CNicotianatabacum)等。在人工接种的情况下还可以侵染茄科、黎科、葫芦科、蔷薇科和豆科的100多种植物。A.2 病害症状ToRSV主要侵染多年生植物，在桃和其他李属植物上表现黄芽花叶症状;挑、樱挑和一些李属植物上表现茎部蚀损斑和退化症状;李树被ToRSV侵染后产生褐色线条;ToRSV侵染苹果树后嫁接部位上方膨大，接穗和础木连接处的树皮异常增厚并呈海绵状，剖开树皮后可发现明显的坏死线，苹果树也可出现衰退症状;ToRSV在红树莓Credraspberry)上表现环斑和衰退症状;葡萄等多种植
9、物被ToRSV侵染后均可出现衰退症状。A.3 分布地区ToRSV主要分布于美洲、欧洲、大洋洲、亚洲的一些国家:美国、加拿大、秘鲁、智利、保加利亚、德国、意大利、法国、前苏联地区、前南斯拉夫、塞浦路斯、澳大利亚和韩国、日本等。A.4 传播方式A. 4.1 近距离传播ToRSV在田间主要通过土壤中的剑线虫传播，剑线虫属中可能的传播介体有:Xiphinemaameri canum ,X. californicum , X. incognitum , X. occidium , X. rivesi , X. thornei , X. utahense。机械接种、种子、花粉也能传播该病毒。A.4.2 远
10、距离传播ToRSV通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。4 , . . GB/T 28973-2012 附录B(规范性附录)纳米颗粒增敏肢体金免瘟层析法测定番茄环斑病毒试剂材料B.1 肢体金免疫层析增敏快速检测试纸条样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标番茄环斑病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片，免疫金释放时间小于5min，释放效率大于80%;硝酸纤维素膜的检测线上包被了番茄环斑病毒多克隆抗体;质控线上包被了1mg/mL的羊抗鼠IgG;吸水垫为吸水纸。其结构见图B.L样品流动方向袭警?亏样品垫硝酸纤吸水垫维素膜| 质控线结合垫防吨叩节节附锵PVC背衬其中:玻璃纤维素片=吸水速率
11、大于4s/cm，吸水量大于50mg/cm2 ; 硝酸纤维素膜CNC膜):毛细流动速率大于25s/cm; 吸水纸:吸水速率大于3s/cm，吸水量大于100mg/cm2 ; 聚氯乙烯CPVC)板z初粘力大于或等于3号球，持粘力标准条件下大于80ho 图B.1肢体金免擅层析增敏快速检测试纸条B.2 样晶提取缓冲灌PBST 1 L 亚硫酸铀(NaZS03)l. 3 g PVP(MW24 00040 000) 20 g 叠氮铀(NaN3)0.2 g 4C储存。B.3 PBST缓冲液(洗涤缓冲灌pH7.4)氯化铀(NaCD8 g 5 GB/T 28973-2012 磷酸氢二铀(NazHP04)磷酸二氢梆(
12、KHzP04)氯化饵(KCD吐温-20蒸馆水定容至1L。B.4 增敏试剂1. 15 g 0.2 g 0.2 g 0.5 mL 将1%的氯金酸和10mmol/L的盐酸楚肢按1: 5的体积比混合，温合后5min内使用。B.5 阴性对照取1g的一200C下保存的健康叶片组织，用研钵液氮研磨粉碎，加入2mL样品提取缓冲液，40C离心10min (3 000 g5 000 g)，取上清液制备成阴性对照。B.6 阳性对照取1g的一20oc下保存的灭活的病叶组织，用研钵液氮研磨粉碎，加入2mL样品提取缓冲液，4 oc离心10min (3 000 g5 000 g)，取上清液制备成阳性对照。6 -. NFON
13、|的hNH阁。- 华人民共和国家标准番茄环斑病毒栓在鉴定方法纳米颗粒增敏肢体金免在层析法GB/T 28973-2012 国中铸中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。0004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷印张O.75 字数12千字2013年4月第一次印刷开本880X12301/16 2013年4月第一版* 书号:155066. 1-46401 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28973一2012打印日期:2013年4月23日F002
