1、中华人民共和国国家标准大型水蚤测试标准方法Standard methods for bloa回ay。fdaphnla magna straus GB/T 16125 1995 本标准部分参照国际标准ISO6341.1982水质一一大型水蚤(甲壳纲、枝角目)活动抑制的测定(UDC 617.777: 576.097.2)及美国标准法水和废水标准检验法804B.水蚤Daphnia)的生物检测步骤。1 主题内容与适用范围本标准规定了大型水蚤生物测试技术中生存及运动影响(急性试验)和生长及繁殖试验方法(慢性效应)。本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性，评价工业废水及工业固休废物浸出液的综合毒性;评价废水
2、处理效果;也适用于地面水、地下水的毒性评价及水中沉积物的毒性评价.2 方法原理2. 1 测定初始浓度EC值，此浓度是指在本标准规定的条件下，24h及48h内使50%暴露在试验液中的大型水蚤失去活动能力的浓度，并指出使所有实验水蚤失去活动能力的最低浓度，及不能使任何实验水蚤丧失活动能力的最高浓度。2.2 测定初始浓度LC值，此浓度是在本标准规定的条件下24h及48h内使50%暴露在试验液中的大型水蚤心脏停止跳动能力的浓度，并指出使所有大型水蚤死亡的最低浓度及不引起死亡的最高浓度。2.3 测定生长曲线，不同浓度下实验水蚤生长的速度不同，其生长曲线也不同，与对照组生长曲线比较判断其生长影响。2.4
3、测定生殖量，相同条件的实验水蚤在不同浓度实验液中由于毒性作用，其每胎生出的幼水蚤数量不同，与对照组比较判断其毒性。3 试剂和材料3.1 试验生物采用大明水蚤(Daphniama自由slraus)62Dm纯品系生物株，为同龄同母体后代。EC50及LC试验用1龄3龄水蚤，每容器10个，平行23组，繁殖及生长试验用刚出生的幼水蚤，每浓度组56个水蚤。3.2 稀释水可采用未被有毒物质污染的天然水(地面水或地下水)及自来水(自然暴气的)，pH值为78.6.溶解氧4mg/L以上，或空气饱和氧的60%以上，水的硬度为250:1:22mg/L(以CaCO，表示).也可用符合上述条件的人工配制水。3.3仪器3.
4、 3. 1 一般实验室玻璃仪器。国家技术监督局1995-12-15批准1996-0卜。1实施599 3. 3. 2 溶解氧测定仪。3.3. 3 体视显微镜。3. 3.4 pH 计。GB!T 16125一19953.3. 5 试验容器z玻璃制结晶皿或烧杯。3. 4 试样及实验的制备3. 4. 1 试样要求有代表性，采样瓶应充满水，采到的废水样品要求在6h内进行毒性测定，否则必须冷藏。3. 4. 2 试验溶液的制备3. 4.2.1 储备液的制备在无离子水中将已知最的被测物质溶解，先配制高浓度的实验原液，按10的倍数连续稀释成各不同浓度，用mg!L表示，对不溶性物质配高浓度原液时可加少量有机溶剂助溶
5、如丙嗣).但各实验液有机溶剂的最终浓度不得超过0.5mg!L.同时须加溶剂对照。3. 4.2.2 工业废水原水样为实验原液，作为100%.用稀释水按百分数(百分率)配制成各浓度。3. 4.2.3 工业固体废物。首先磨碎，按固液1, 10比例加入无离子水，摇匀后浸泡24h.滤纸过滤，其溶解部分为被测王业固体废物的漫出原液(100%).再用稀释水按百分数配制成各浓度。4 试验步骤4. 1 大型水蚤EC及LC实验4. 1. 1 预试验确定正式试验的浓度范围，要求得知试验藻全部存活(或无影响的浓度以及全部死亡(或不动)的浓度，确定被测样品是否稳定，实验水蚤是否健康。4.1.2 正式试验Ih ?号浓度中
6、实验水蚤的死亡数得出LC结果。由各浓度中实验水蚤的不活动数得出EC结果。实验开始及结束时测定实验液的pH值、水温和溶解氧()。对不稳定性实验液采用定时更换的措施，实验期间实验水蚤不喂食。4.2 大型水蚤的繁殖及生长实验(慢性效应4.2.1 预试验做48h LC试验，由48h LC X O. 1得到不引起水蚤死亡的浓度，在水蚤的生存安全浓度范围内选择23个生民繁殖试验浓度。4.2.2 正式试验按预试验选好的浓度配制各浓度实验液，平行4-6组，每组设一对照，实验在正常实验室光照下进行，防止直射阳光。实验开始及结束时测定pH及00-，用最高、最低温度计记录实验全程的气温。实验期间.每24h在固定时间
7、用吸管取出实验幼水蚤，分别移入相对应的栅藻藻液缸中喂1h后，移回中毒缸，即时更换中毒液.4.3 实验水蚤的敏感度测定用分析纯重错酸僻测定大型水蚤24h EC，。在2mg!L以下，表明本实验水蚤的敏感度合格-4.4 数据处理与实验结果4.4. 1 EC及LC试验用半对数纸或概率纸获得EC及LC50值，也可用计算机LC切程序处理数据.实验结果用mg!L或百分数表示，实验中对照组应无异常。4.4.2 繁殖及生长试验以观察时间为横坐标，平均体长为纵坐标，画出各浓度生长曲线，与对照组生长曲线做比较，判断出作用浓度及不作用浓度。统计各实验液中幼水蚤总数，得出生殖总量及生殖量(每胎平均生幼水蚤数) 600
8、GB/T 16125-1995 比较是否与对照组有显著差异，实验期间对照组应无异常。5 试验报告在明确采用本标准方法情况下，还包括za. 实验用大型水蚤的来源、种名、品名、数目、年龄、理11养时间、健康状况等等gb. 被测物质的名称、来源、理化性质、采样时间及储藏等，以及实验液的配制gC. 实验方法、条件、稀释水等，d. 数据处理，及24人48h的ECso、LCso结果。生长曲线以及生殖量，中毒症状，0%及100%影响浓度。601 GB/T 16125-1995 附录A大型水蚤的培养繁殖技术(补充件)A1 在12L的圆玻璃缸或烧杯中，加入500mL1 000 mL培育水(自然曝气三天以上的自来
9、水或未经污染的过滤地面水)，加入1020个大型水蚤，投喂新鲜栅藻藻液，使藻浓度为(68)X 10个/mL最佳，在室内自然光照条件下进行培养，避免阳光直射，培养温度15250C，pH值为705士O.5，溶解氧2 mg/L以上，每周全换培养液12次.A2 实验幼水蚤的分离选择怀卵量高的水蚤1020个，投喂充足的饵料，在实验前24h用孔径为1mm的筛子将幼水蚤滤去，在实验前612h进行第三次过筛，所得到新出生的幼水蚤为出生624h大小的幼水蚤，将此水蚤再继续培养两天即得出生72h的实验水蚤。A3 栅藻(5cenedesmus)的培养采用人工培养的栅藻藻液喂养大型水蚤，用下列无机盐作为栅藻藻种的营养液
10、。硫酸锁(NH山50，, 硫酸缓(Mg50，. 7H,O) 碳酸氢销(NaHCO，), 磷酸二氢惆(KH，PO，), 0.2 g; O. 1 g; O. 1 g; O. 02 g; 氯化钙(CaCl， 2H,O) , 0.03 g; 无离子水1 OSJO mLo 栅藻种可在大三角瓶中、在1525C水温、40W日光照下(8h16h)进行培养，每天搅拌56次。经上述配方培养的栅藻藻种用稀释水扩大培养，按1; 1 (藻液与稀释水比)或1; 2接种，并每3天追加腺素l次，使腺素最终浓度不超过10mg/L，可用此栅藻藻液直接喂大型水蚤。附加说明:本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准由中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所负责起草。本标准主要起草人z修瑞琴、高世荣、许永香、任改英、郭琪。本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院环榄卫生监测所负责解罄。602
