1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1638-2005 国境口岸莱姆病监测规程Codes of surveillance for Lyme disease at frontier port 2005-09-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2006-05-01实施060509000091 前言本标准附录C为规范性附录，附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 1638一2005本标准起草单位:中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、齐齐哈尔市商业职工医院。本标准主要起草人:范东辉、郭晓明、张国彬、
2、曹晓兰、李明、吴刚、薛芳。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 国境口岸莱姆病监测规程1 范围本标准规定了国境口岸莱姆病的监测对象、内容与方法、结果处置。本标准适用于检验检疫系统对国境口岸莱姆病疫情的监测。2 规范性引用文件SN/T 1638-2005 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 16882 动物鼠疫监测标准SN/T 1293 国境口岸蝉类监测规程SN/T
3、1312 国境口岸森林脑炎监测规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 游走性红斑erythema migrant , EM 典型者开始为红色斑痊或丘磨，数天或数周内向周围扩散形成大的圆形皮损，中心色淡。单个皮损直径至少为5cm，可发生继发性皮损。多数患者通常伴有其他急性症状，如疲乏、发热、头痛、轻度颈强直、关节痛及肌痛，这些症状呈间歇性。但叮咬后数小时内出现的环状红斑系机体超敏反应所致，不属于EM。4 对象4. 1 国境口岸莱姆病监测人群，包括:一一边境居民;一一人出境人员;一一一国境口岸工作人员。4.2 莱姆病传播媒介和宿主动物，包括:一一传播媒介，已证实的传播媒介为全沟硬蝉
4、Ixodesersulcatus、肩突硬蝉Ixodesscaularis (= 1. dammini)、太平洋硬蝉Ixodesacificus、蓝子硬蝉Ixodesricinus。宿主动物，主要是啃齿动物，家畜、鸟类、爬行动物也可成为贮存宿主。4.3 来自疫区的动物。4.4 国境口岸生态环境。5 内容与方法5. 1 资料的收集监测活动应收集以下资料:SNjT 1638-2005 一一利用各种方式收集国内、国际莱姆病疫情资料;一同地方疾病预防控制机构、医疗机构、涉外宾馆、俱乐部及动物防疫机构建立莱姆病疫情报告、通报制度，定期进行疫情资料的整理分析并互通疫情情报;一一建立健全口岸莱姆病登记制度;一
5、一一通过统计部门收集监测地区的人口资料;一-利用本底调查等方式收集动物贮存宿主及媒介分布资料。5.2 人群瘟情监测5.2.1 现场监测在国境口岸通过查验入出境人员健康申明卡、体温检测、医学巡查、健康咨询等手段及时发现可疑病例。具有游走性红斑者或至少有一种下列表现并经实验室证实感染者可诊断为莱姆病:一一肌肉骨酷系统表现，反复发作的、短时间(持续数周或数月)的一个或几个关节受累，有时可发展为慢性关节炎。但发病前无短暂受累期的慢性进行性关节炎及慢性对称性多关节炎应除外。一-神经系统表现，包括淋巴细胞性脑膜炎、脑神经炎、特别是面神经麻痹(可为双侧)、神经根病或较少见的脑脊髓炎。其中脑脊髓炎诊断应有脑脊
6、液抗博氏包柔螺旋体抗体检测的依据，且脑脊被抗体滴度应比血清高。仅有头痛、疲乏、感觉异常及轻度颈强直应除外。一-心血管系统表现，急性起病CII度或田度)房室传导阻滞，常在数天或数周内恢复正常。单纯的心悸、心动过缓、束支传导阻捕或心肌炎应除外。5.2.2 血清学监测运用血清流行病学方法，在国境口岸重点人群中收集300份血清进行检测，血清学检测方法参见附录A或采用经国家食品和药品监督管理部门批准生产的试剂盒，并严格按照操作说明进行检测，查清本口岸地区人群的莱姆病感染状况。5.2.3 个案调查在国境口岸地区发现莱姆病病人，应进行流行病学调查，着重询问林区旅行史、宠物接触史和蝉的叮咬史，并填写个案调查记
7、录，参见附录B。5.3 媒介与宿主动物监测5.3. 1 每年开展至少4次媒介和宿主动物的调查。5.3.2 国境口岸鼠类种群密度及季节消长情况监测方法按照GB16882进行，鼠的带蝉率调查方法按照SN/T1312进行。5.3.3 国境口岸蝉类种群密度及季节消长情况监测方法按照SN/T1293进行，蝉的带菌率调查方法见附录ca蝉在保存和运输时应放置于玻璃管内，并加入适量的湿滤纸条，以三层纱布封住管口，放在阴凉处或40C冷藏。5.3.4 宿主动物血清学调查方法参照5.2.2进行，血清学检测使用诊断试剂盒。5.4 来自疫区的动物监测使用诊断试剂盒对来自疫区的动物进行莱姆病血清学调查。5.5 口岸生态环
8、境监测2 生态环境监测内容包括:一动物地理区特点，如动物种群构成和分布;一-气象特点，如月平均气温、相对气湿、降水量;一地貌特点，如山地、丘陵、荒模、草原、洼地、水源、岛屿、植被种类与面积;一+地质特点，如地表层结构土质、岩石;一生产活动特点，如地表建筑、生活设施、储运货物类型和种植业、养殖业类型。SN/T 1638一20056 处置6. 1 瘟情通报监测中发现莱姆病病人后，应向上级主管部门报告，同时向当地卫生行政部门通报。6.2 防护措施对前往有确诊的莱姆病病人或已证实有蝉媒介感染伯氏疏螺旋体的区域的人员，应采取防止蝉叮咬措施。6.3 监测报告根据年度监测结果，汇总监测地区人口资料、动物贮存
9、宿主及媒介分布资料，写出国境口岸本年度莱姆病监测报告。报告中应包括如下内容:一一监测概况;一一监测方法;一一-监测结果;结论;一一预防措施和建议。3 SN/T 1638-2005 A.1 间接免疲荧光抗体法CIFA)A. 1. 1 材料附录A(资料性附录)莱姆病抗体的血清学检测A. 1. 1. 1 多孔抗原片:用国内参照菌株PD91，用BSK培养基培养，常规制备，每视野(40X10)螺旋体数不少于100条。一200C干燥保存。A. 1. 1. 2 羊抗人或兔抗人IgM或IgG荧光素结合物。A. 1. 1. 3 待检病人血清。A. 1. 1.4 荧光显微镜。A. 1. 1. 5 常用稀释液、试剂
10、及设备(370C恒温孵箱等)。A. 1.2 检测步骤A. 1. 2. 1 血清从1: 16开始，用3%卵黄囊PBS(pH7.2 , 0.01 mol!L)稀释，2倍连续稀释至需要稀释度。A. 1. 2. 2 取出抗原片，室温风干，用加样器依次从高稀释度至低稀释度方向逐个加入已稀释的待检血清10L15L，370C，保湿反应30min。A. 1. 2. 3 用pH7.2 0.01 mol/L PBS浸泡10min，纯水漂洗3次，室温风干。A. 1. 2. 4按一定的工作稀释度，用pH7. 2 O. 01 mol/L PBS稀释荧光结合物，每孔加入10L15L，37C，保湿反应30min。A. 1.
11、 2. 5 用pH7.2 0.01 mol!L PBS浸泡10min，纯水漂洗3次，室温风干，90%甘油封片。A. 1. 2. 6 荧光显微镜(40X10)下检查，每视野下不少于50%的螺旋体染上明亮的荧光者可判为阳性。+:菌体稍膨胀，呈明亮的谈绿色荧光;+:菌体清晰，呈明亮的谈绿色荧光;+:菌体能分辨清楚，但荧光亮度稍差;士:菌体模糊，形态不典型，亮度差;一:看不见菌体。A. 1.3 结果判定以十为判定终点，单份血清滴度，lgM二三1: 64 , IgG二三1: 128，或双份血清抗体滴度呈4倍增高者，可判为阳性反应。A. 1.4 意义双份血清IgG阳性稀释度呈四倍或四倍以上增高者，可确诊感
12、染。单份血清检测IgG阳性，一般表明其曾受过莱姆病螺旋体感染;lgM阳性，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近或活动性感染。A.2 酶联免瘟吸附试验(ELISA)A.2.1 材料A. 2. 1. 1 聚苯乙烯塑料板，96孔、可拆式、U型板。A.2. 1. 2 可变微量加样器，10L200J.1 Lo A. 2. 1. 3 抗原制备:用BSK培养基常规培养中国莱姆病螺旋体参照菌株PD91，以10OOOr/min离心30 min,O. 01 mol/L pH 7.4 PRS洗海3次，收集菌体，冰镇下超声粉碎30min, 4 OOOr/min离心20min，去SN/T 1638-2005 沉淀取
13、上清，Sephadex G 100柱层析，流速为20滴/min，280 nm波长紫外监测下收集，浓缩至2 mg/mL4 mg/mL，测定蛋白含量，十二烧基硫酸铀(SDS)聚丙烯眈胶凝胶电泳分析，所得样品含有外膜蛋白A(32KD)、外膜蛋白颐指KD)、外膜蛋白C(22KD)和鞭毛蛋白(41KD)四种纯化蛋白抗原。A. 2.1.4 酶结合物:辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG( HRP-IgG )或IgM( HRP-IgM) ，加保护剂(0.01 mol/L pH 7.4 PBS加0.01%硫柳柔和1%牛血清白蛋白)。A. 2. 1. 5 阳性对照血清(典型病人阳性血清)，阴性对照血清(无暴露史的健
14、康人血清)。A. 2. 1. 6 包被液:0.1mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液。A. 2.1.7洗涤液:即O.01 mOl/L pH 7. 4 PBS-T (NaCl 8. 0 g , KHzP04 O. 2 g , KCl O. 2g , Naz HP04 12Hz 0 2. 9 g , Hz 0 1 000 mL, Tween-20 O. 5mL) ，高压后使用。A. 2. 1. 8 稀释液:即高压后的PBS-T液加5%牛血清。A. 2.1.9 底物液:以拧攘酸、磷酸氢二销和EDTA为缓冲系统加TMB和过氧化氢尿素配制的显色底物，配方见表A.1。A液磷酸氢二锅36.82 g 拧橡酸
15、10.21 g 过氧化氢尿素0.6 g 去离子水1000 mL A. 2. 1. 10 终止液:2mol/L HZS04。A.2.2 检测步骤表A.1底物配方B液拧橡酸10.5 g EDTA O. 146 g 去离子水1000 mL TMB 0.25 g A. 2. 2.1将提取的纯化蛋白抗原用包被缓冲液(pH9. 6碳酸盐缓冲液:NaZC03 1. 95g, NaHC03 2. 93 g , Hz () 1 000 mL)稀释至20g/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，40C包被24h，取出抗原板，空干，用O.01 mol/L pH 7. 4 PBS (NaCl 8. 0 g , KHzP
16、04 O. 2 g , KCl O. 2 g , Naz HP04 12H20 2.9 g , H20 1 000 mL)配制的1.0%脱脂奶粉(重量百分比)，每孔0.2mL，40C封闭24 h，取出，用0.01mol/L pH 7.4 PBS洗涤5次，室温风干，密封备用。A. 2. 2. 2 用0.01mol/L pH 7.4 PBS适当稀释待检样品(单份血清稀释度为1: 500)和酶结合物，各取50L加入抗原板孔内，370C40 min，取出，用0.01mol/L pH 7.4 PBS洗涤5次，室温风干。A. 2. 2. 3 取显色底物洛液A和B各50L加入孔内，避光370C15 min2
17、0 min，每孔加入2mol/L HZS0450L终止反应。A. 2. 2. 4 空白孔调零，用酶联免疫检测仪450nm波长测吸光度(A)，即A值。A.2.3 结果判定以特异性抗莱姆病螺旋体抗体为阳性标准对照和无特异性抗体的阴性对照作判断结果的标准。当标准阳性对照的A值二三0.20，阴性对照的A值0.06时，样品孔A值二三O.15者为阳性，A值0.15者为阴性。A. 2. 4 意义双份血清IgG阳性稀释度呈4倍或4倍以上增高者，可确诊感染。单份血清检测IgG阳性，一般表明其曾受过莱姆病螺旋体感染;IgM阳性，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近或活动性感染。5 SN/T 1638-2005
18、 附录B(资料性附录)莱姆病病例个案调查记录B.1 编号B. 1. 1 病例编号B. 1.2 调查日期年月日B. 1.3 调查单位B. 1.4 调查人B.2 基本情况B.2.1 病人姓名B. 2. 2 性别a)男b)女B.2.3 国籍B. 2. 4 出生日期一一一-一年-一一一月一二-日B.2.5 详细住址B. 2. 6 联系电话B. 2. 7 职业B. 2.8 病例报告单位名称B. 2. 9 病例报告日期年月日B.3 流行病学史B.3.1 发病前数天或数周到过疫区、或在疫区居住a)有b)无c)不知道B.3.2 家养宠物(如狗、猫、鸽子等)a)有b)无c)不知道B.3.3 蝉的叮咬史a)有b)
19、元c)不知道B.4 临床症状和体征B. 4.1 游走性红斑a)有b)无c)不知道B.4.2 皮肤多发性环状损害a)有b)无c)不知道B. 4. 3 局部淋巴结肿大a)有b)元c)不知道B.4.4 疲劳、嗜睡a)有b)无。不知道B. 4. 5 头痛a)有b)无c)不知道B. 4. 6 发热发冷a)有b)无c)不知道B. 4. 7 颈项强硬a)有b)元c)不知道B. 4. 8 关节痛a)有b)无。不知道B.4.9 肌痛a)有b)无。不知道B.4.10 神经症侯一-一脑膜炎症状(如头痛、发热、颈强)a)有b)无c)不知道一一脑神经炎(如面神经麻痹)a)有b)无c)不知道一一神经根炎及周围神经炎(如游
20、走性神经根疼痛及感觉异常)a)有b)元c)不知道B. 4. 11 房室传导阻滞a)有b)无c)不知道6 B.4.12 间歇性发作的非对称性关节肿胀和疼痛B. 4.13 慢性萎缩性肢皮炎B.5 实验室检测B.5.1 间接免疫荧光抗体法(IFA)B.5.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)SN/T 1638-2005 a)有b)无c)不知道a)有b)无c)不知道a)阳性协阴性a)阳性b)阴性7 SN/T 1638-2005 C.1 直接荧光抗体染色法附录C(规范性附录)蝉带菌率调查方法C. 1. 1 准备同一种类的蝉15只ZO只，用手术刀片取蝉中肠涂片，自然干燥。C. 1.2 用丙酣固定15min，
21、室温风干。C. 1.3 滴加定量的异硫氨酸荧光素标记的抗莱姆病螺旋体特异性抗体，370C，保温染色30mino C. 1.4 用pH7.2 0.01 mol/L PBS浸泡10min，纯水漂洗3次，室温风干后用90%甘油封片。C. 1.5 荧光显微镜(40X 10)下检查，发现染上明亮淡绿色荧光的典型疏螺旋体者即可判为阳性。每份样本至少检查(80100)个视野，阴性者方可放弃。C. 1.6 计算检出率根据螺旋体检测为阳性的蝉数分别计算不同蝉种的带菌率。检出率计算方法见式(C.1)。=主x100% .( C.1 ) 式中ta-一-检出率;b一阳性蝉数pc一蝉检测总数。C.2 莱姆病螺旋体分离培养
22、C. 2.1 将蝉用元菌纯水洗涤3次，滤干水，加75%酒精洗3遍并浸泡15min消毒。C.2.2 用无菌的PBS缓冲液冲洗三次，无菌滤纸吸干。C.2.3 将同一种类蝉5只一组，放入专用灭菌研磨器中，加入0.5mL BSK n培养基充分研磨。C.2.4 以每管O.1 mLO. 2 mL接种于5mL的BSKn培养基中，接种两管，330C恒瘟培养，5d7 d 后暗视野显微镜下检查，发现可疑培养物要立即传代，以便鉴定证实。C.2.5 如果未发现阳性培养物，可盲传一代，培养5d7 d后检查，以后每1d2 d检查-次，2个月如无阳性者可弃去。C. 2. 6 计算检出率和最低带菌率根据从蝉中分离的菌株阳性数
23、计算蝉的带菌率。检出率和最低带菌率计算方法分别见式(C.2)、式(C.3)。8 式中zd 带菌率;e一分离菌株数pf一-分组数。d=?1州.(C.2 ) SNjT 1638-2005 g=主x100% ( C.3 ) 式中:8一一最低带菌率;e一一分离菌株数;C一一一蝉检测总数。注:最低带菌率是指每只蝉伯氏疏螺旋体的携带率。9 mCON-的-H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸莱姆病监测规程SN/T 1638 9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷导开本880X12301/16 印张1字数16千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数1-2 000 7c 定价10.00关书号:155066.2-16574
