1、l!I才己中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1129.2二2002牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离操作规程2002 - 08 -02发布Protocol of virus isolation for bovine - viral diarrhea/mucosal disease 2003 - 01-01实施融于自家革命晶晶金&自发布SN/T 1129.2-2002 前言本标准中有关病毒分离和鉴定方法是参考美国、澳大利亚实验室的检测规程和总结我国在这一领域多年研究和实践经验的基础上制定。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本标准负责起草单位:中华人民
2、共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人:周晓黎、花群义、徐自忠、徐维加。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN /T 1129. 2-2002 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离操作规程1 范围本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离和鉴定方法。本标准适用于动物感染牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离和鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682
3、 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略i吾下列缩略语适用于本标准。CPE 致细胞病变作用。TCIDso 半数组织培养感染量。BVD/MD 牛病毒性腹泻/粘膜病。SPF 元特定病原体。4 原理动物感染BVD病毒并产生抗体后，在较长一段时间里病牛的许多组织中有病毒的存在，急性病例具有持续的病毒血症，所以血液是最好的病毒分离材料，采取凝固的血块，经冻融几次后作为接种物。尸体剖检时则采取肠系膜淋巴结或脾脏，也可应用骨髓经常规处理后作为接种物。发病较久或怀疑有抗体存在时，用上述病料分离病毒，可能会受到干扰，此时可采抗凝血，分离白细胞作为接种物更为理想，检查局部感染时，可用棉拭子采取局部的分泌物或排泄物。
4、各种牛源细胞均可用于病毒分离，包括牛肾和胎牛肺原代细胞或继代细胞以及棋牛辜丸细胞。棋牛原代辜丸细胞常可显示较好的细胞病变。分离株若引起细胞病变，则应进一步用抗BVDV的免疫血清进行中和试验鉴定。若无细胞病变，则用免疫荧光抗体试验(FA)，免疫过氧化物酶试验、中和试验等方法进行鉴定。病料接种于敏感细胞后至少应传两代以上，方可进行鉴定。5 试剂和材料5. 1 71.:本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。5.2 病毒:BVD病毒OregonC24V 0 5. 3 血清:BVD标准阳性血清、阴性血清。5.4 被检样品:凝固的血块、肠系膜淋巴结或脾脏、骨髓、自细胞、分泌物或排泄物，经研磨冻
5、融几次后作为接种物。若需要长途运输，应将病料置入含有高浓度抗生素的运输液中(每毫升5000 IU青霉素，5 000月链霉素和10阳两性霉素B)。5. 5 细胞:试验所用的细胞为原代或次代棋牛肾细胞或辜丸细胞，一般不超过四代，按常规膜酶消化方SN/T 1129.2-2002 法制备(所用棋牛应无BVD污染)。5.6 培养液:199培养液，生长液中加10%棋牛血清，维持液中加3%(或无)棋牛血清(使用前应检查血清不含BVD抗体和无BVD病毒污染)，含青霉素200IU/mL、链霉素200吨/mL。5. 7 细胞分散液:0.25%膜蛋白酶。5.8 碳酸缓冲液甘油:配方见附录A.905.9 丙目目。5.
6、10 FITC标记的BVD/MD病毒抗体。5.11 带盖的温盒。6器械和设备6.1 乳钵或组织捣碎器。6.2 载玻片和盖玻片盖玻片为18mmX 18 mmX 0.17 mm，用砂轮切划成适当大小的飞片，按细胞培养用玻璃器皿的洗涤和处理方法处理后备用。6.3 超声波裂解器。6.4 倒置显微镜。6.5 荧光显微镜。6.6 微型振荡器。6. 7 二氧化碳培养箱。6.8 冰箱20 C保存血清，-70C保存种毒。6.9 组织培养板(96孔或24孔)。6.10 单头和多头微量移液器及滴头20L200L。7 病毒分离用含10%棋牛血清的199营养液制作棋牛原代或次代辜丸和肾细胞，在24孔板中培养。每孔加入1
7、 mL细胞悬液(细胞浓度为1X 105个/mL)，置37-C、5%二氧化碳培养箱培养，24h内长成单层细胞。在每孔加入100L样品，加盖用振荡器轻振。置37C、5%二氧化碳培养箱中吸附1h。然后每孔加1mL 维持液，37C、5%二氧化碳培养箱培养6d。在培养第5天、第6天观察CPE，如有50%以上细胞出现CPE，收获该孔培养物，低温保存备用。如不出现CPE.6d后将培养物冻融二次至三次，并将同一样品两孔细胞培养物泪合4CC保存备用。阳性对照(接种BVD病毒)两孔，阴性对照(细胞对照)两孔。8病毒鉴定8.1 直接免瘟荧光抗体染色8.1.1 梓晶制备24孔板每孔加入一片飞片，然后加入制作好的原代细
8、胞悬液(或直接用96孔培养板进行细胞培养)，待长成单层细胞。吸出孔内培养液，每孔接种第一代培养解冻物0.1mL，每份样品两孔，加盖，用振荡器轻振，置37C、5%二氧化碳培养箱吸附1h，每孔加维持液.37C、5%二氧化碳培养箱培养，每天观察CPE，详细记录观察结果，培养3d5 d后对培养物进行鉴定。阳性对照的继代第一代培养物，阴性对照的继代第一代培养物。如果是玻片培养，取出孔内盖玻片，用PBS(pH7.6)漂洗盖玻片，自然干燥;如果是直接用96孔板培养，倒出孔内液体，用PBS(pH7.6)清洗，自然干燥。用预冷丙酣固定10min 15 min，空气干燥。用PBS将FITC标记的BVD抗体结合物稀
9、释至工作浓度，滴加于细胞表面，置湿盒37C染色90mino在PBS中漂洗三次，蒸锢水漂洗一次，用碳酸盐缓冲液甘油封片上。2 8.1.2 荧光显微镜检查在490nm495 nm紫外光下观察，用520口m530nm(绿色)的滤光片。没有被BVD病毒感染的整个细胞无荧光或仅有极微弱的荧光。SN/T 1129.2-2002 被BVD病毒感染的细胞在细胞质内有明亮的黄绿色荧光，但需用阳性血清抑制试验进一步确认。8.1.3 阳性血清抑制试验a) 在已被丙酣固定好，尚未做直接免疫荧光抗体染色的盖玻片或96孔板加上BVDV阳性血清，置3TC湿盒内作用30mino b) 在PBS中漂洗三次。c) 用PBS将FI
10、TC标记的BVD抗体结合物稀释至工作放度，滴加于细胞表面，置湿盒37C染色90 min，在PBC中漂洗三次，蒸馆水洗一次，用碳酸盐缓冲液甘油封片上，进行荧光显微镜检查。8.1.4 结果判定首先检查对照样品:阳性对照样品应在直接免疫荧光抗体染色后有明亮的黄绿色荧光，而在阳性血清抑制试验中无荧光;阴性样品则在直接免疫荧光抗体染色后没有黄绿色荧光(或仅有极微弱的荧光)。对照合格后才能进一步判断待检样品。如果直接免疫荧光抗体染色后有明亮的黄绿色荧光，而在阳性血清抑制试验中元荧光则为特异性抗原抗体反应，判为阳性。如果直接免疫荧光抗体染色后没有荧光(或极微弱荧光)判为阴性;或者虽有明亮的黄绿色荧光，但在阳
11、性血清抑制试验中仍有明亮的荧光则为非特异性荧光，判为阴性。8.2 间接过氧化物酶染色法8.2.1 样晶制备同第7章在96孔板制作单层细胞。吸出孔内培养液，每孔接种第一代培养解冻物50L，每份样品四孔，加盖用振荡器轻振。置37C、5%二氧化碳培养箱1h 0每孔加含3%棋牛血清的199液50L，37 C、5%二氧化碳箱培养72h96 h，每天观察CPE情况，详细记录观察结果。阳性对照的继代第一代培养物，阴性对照的继代第一代培养物。8.2.2 固定吸出培养液，用PBST轻轻冲洗一次，注意防止细胞脱落，每孔加150L预冷的丙酣，室温固定30 min，弃固定液，甩干，用PBST洗三次，每孔加150L5%
12、脱脂奶粉封闭，置湿盒中3TC培养1h，用PBST洗三次。8. 2. 3 细胞染色在除阴性对照和标记抗体对照孔之外的所有孔中加入50L工作浓度的阳性血清，阴性对照孔加50L与阳性血清相同稀释度的阴性血清，标记抗体对照孔加50LPBST，置37C培养1h，用PBST洗三次，每次轻轻振荡3min5 min，最后一次甩干。每孔加50L兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物，置3TC培养1h，再用PBST洗三次，每次轻轻振荡3min5 min，最后一次甩干。8.2.4 显色每孔加100L底物(AEC)(现配现用)。室温反应30min后用显微镜检查。8. 2. 5 结果判定必须首先检查阳性对照和阴性对照，成立后
13、方可进行判定。被BVD病毒感染的细胞呈红褐色;没有被BVD病毒感染的细胞则不会着色。3 SN /T 1129. 2-2002 A.1 PBS 氯化铀(NaCl)磷酸氢二铀CNazHP04 12HzO) 磷酸二氢铀(NaH2P04 2HzO) 7.k 附录A(资料性附录)试荆配制8.5 g 3.116 g 0.203 g 1 000 mL 用1mol/L盐酸、1mol/L氧化铀调pH7.6。A.2 PBST PBS 吐温【20A.3 专用稀释:在PBST 脱脂奶粉A. 4 乙酸缓冲液乙酸铀蒸馆水用硫酸或氯化铀调pH至5。A.5 AECC3氨基9乙基咔睡、3-A-9EC)溶班(注意:可能致癌，操作
14、时应戴手套和口罩)3-A-9EC 2. 5 mg 1 000 mL 500L 100 mL 5 g O. 681 g 100 mL 溶解于1mL N-N-DMF中CN-N-Dimethylformamide)，现配现用。A.6 底物AEC榕液乙酸缓冲液双氧水(HzOz)现配现用。A.7 阳性血清1 mL 19 mL 10L 单克隆抗体CF10(先作1/10稀释)-20C贮藏。工作浓度按说明书稀释。A.8 酶结合物过氧化物酶标记的兔抗羊IgG工作浓度按说明书稀释C4C保存)。4 A.9 碳酸缓冲液甘油碳酸缓冲液:0.5 mol/L碳酸氢铀3 mL 0.5 mol/L碳酸铀1 mL 取中性甘油9份
15、，碳酸缓冲液1份，充分混合，即成。SN/T 1129.2-2002 5 NCONN-mN同Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离操作规程SN!T 1129. 22002 -x 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷68517548 民印张3/4字数15千字2002年11月第一次印刷开本880X1230 1/16 2002年11月第一版印数1-2 000 定价8.00元网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533x 书号:155066 2-14765 SN/T 1129.2-2002
