1、ICS 65.020 B 61 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1843一2010葡萄无病毒母本树和苗木Virus-free mother plant and nursery stock of grapevine 2010-05-20发布2010-09-01实施中华人民共和国农业部发布NYjT 1843-2010 前本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位z中国农业科学院果树研究所、农业部果品及苗木质量监督检验测试中心(兴城)。本标准主要起草人:董雅风、张尊平、刘凤之、范旭东、聂继云、李静。I NY/T 1843
2、-2010 葡萄无病毒母本树和苗木范围本标准规定了葡萄无病毒母本树和茵木的质量要求、检验规则、检测方法、包装和标识。本标准适用于葡萄无病毒母本树和苗木的繁育及销售。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为木标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY 469 葡萄苗木全国农业植物检疫性有害生物名单(农业部公告第617号，2006年3月)3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 葡萄无病毒原种vir
3、us-free primaso盯ceof grapevine 通过脱毒处理或无性系筛选获得、经单株检测元病毒后隔离保存的原株。3. 2 葡萄无病毒母本树viruS严freemo由erplant of grapev姐e葡萄无病毒原种材料繁育的、用于提供品种或时木繁殖材料的无病毒母株。3.3 葡萄无病毒础木virns-free rootstock of grapevine 从元病毒石占木母本树上取得繁殖材料、经轩插或通过组培获得用于嫁接的葡萄础木苗。3.4 葡萄无病毒接穗virus-free scion of grapevine 从元病毒母本树上获得的、用于嫁接繁殖的当年生新梢或一年生成熟枝条。3
4、.5 葡萄无病毒苗木vir田freenursery stock of grapevine 用无病毒接穗和元病毒础木繁育的葡萄嫁接苗，以及通过抨插、组织培养等方法繁育的葡萄自根苗。4 要求4. 1 葡萄元病毒母本树和苗木元葡萄扇叶病毒CGrapevincfanJeaf virus , GFLV)、葡萄卷叶病毒1CGrapcvinc Jeafroll associatcd virus 1, GLRa V -1)、葡萄卷叶病毒3C Grapcvine Jeafroll associated virus 3，GLRaV-3)、葡萄病毒ACGrapevinevirus A，GVA)和葡萄斑点病毒CGra
5、pevineflcck virus ,GFkV) 0 4.2 无全国农业植物检疫性有害生物名单)(农业部公告第617号，2006年3月)规定的检疫性有害生物。4 3 品种纯正、生长健壮。NY/T 1843-2010 4. 4 葡萄元病毒自根苗和嫁接苗的质量符合NY469的规定。5 试验方法5. 1 葡萄无病毒原种5. 11 葡萄无病毒原种栽培容器中保存于防虫网室或防虫温室中，每个品种5株。每株原种均有编号、来源和病毒检测记录。5.12 每年生长季节观察树体状况，发现有病毒病症状的植株，立即淘汰并销毁。5.13 每5年全部复检一次，带病毒植株立即淘汰并销毁。5. 1.4 病毒检测采用指示植物结合
6、酶联免疫吸附CELISA)或反转录聚合酶链式反应CRT-PCR)方法进行。5 2 葡萄无病毒母本树5.2. 1 葡萄元病毒母本树栽植于没有传毒线虫、6年之内未栽植过葡萄的地块，与普通葡萄园和苗闹的距离大于60m，修剪工具、生产工具及农机具专管专用，并定期消毒。5.2.2 每个生长季节观察树体状况，并抽取5%10%的母本树进行病毒检测。发现有病毒病症状的植株和检测带病毒的植株，立即淘汰并销毁。5.2.3 病毒检测采用ELISA或RT-PCR方法进行。5. 3 葡萄无病毒茵木5.3. 1 葡萄元病毒苗木应在距离普通葡萄园或苗同30m以上、没有传毒线虫且在3年内未栽植过葡萄的地块进行繁殖，修剪工具、
7、生产工具及农机具专管专用，并定期消毒。5. 3. 2 采用随机取样方法抽取苗术进行病毒检测。以1万株抽检10株为基数(不足1万株以1万株计)，10万株内(含10万株)每增加1万增检5株;超过10万株，每增加1万增检2株。5. 3. 3 病毒检测采用ELlSA或RT一PCR方法进行。5. 3. 4 等级规格检验按NY469规定执行。6 检验规则6. 1 指示植物检测6. 11 葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用指示植物进行检测。6. 1. 2用绿枝嫁接、硬校嫁接或芽接方法，将待检样品嫁接到指示植物上，每个样品重复3株06.13 生长季节定期观察指示植物的症状表现，检测用
8、指示植物和症状表现参见附录A。6.2 ELISA检测6.2. 1 葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒1、葡萄卷叶病毒3、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒可采用ELISA方法进行检测。6.2.2 取样部位和时间参见附录B。6.2.3 ELlSA检测具体操作方法参见试剂盒使用说明。6.3 RT-PCR检测6.3. 1 葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用RT-PCR方法进行检测。6.3.2 取样部位和时间参见附录B。6. 3. 3 检测程序参见附录C。7 标识和包装7. 1 标识NY!T 1843-2010 7. 1. 1 葡萄元病毒母本树标签内容包括品种名称、陆木类型、母本树编号、病毒检
9、测单位和检测时间、母本树培育单位。每捆挂2个标签。7.12 葡萄无病毒苗木标签内容包括品种、荷木、等级、株数、生产单位和地址。每捆挂2个标签。7.2 包装分品种、种类(母本树、自根苗、嫁接苗)和等级，分别定量包装，每捆2030株为宜。注意苗木保湿。包装内外附有苗木标签，不应与普通茵木i昆装。3 NY/T 1843-2010 附录A资料性附录)葡萄病毒在指示植物上的症状表现表A.l葡萄病毒在指示植物上的症状表现病毒种类本本指示植物指刁亏植物症状葡萄扇叶病毒沙地葡萄圣乔治CVitisru户四川St. Gorge) 叶片出现褪绿斑点、呈扇形葡萄卷叶病毒欧洲葡萄CVitisvinifera) 叶片下卷
10、，叶脉间变红葡萄病毒AKober 5BB 木质部产生茎沟槽，叶片黄斑葡萄斑点病毒沙地葡萄圣乔治CVitisrupestris St. Gorge) 叶脉透明指虹色品种，常用的有品丽珠(Cabernetfranc)、赤霞珠CCabernetsauvingnon)、黑比诺(Pinotnoir Missio川、蜜笋CMission)、巴贝拉CBarbera)等。4 NY/T 1843-2010 附录B资料性附录)ELISA和RT-PCR检测适宜时期和取样部位表B.1 ELISA和RT-PCR检测适宜时期和取样部位ELlSA检测RT-PCR检测病毒种类适宜时期取样部位适宜时期取样部位葡萄扇叶病毒新梢生
11、长期嫩叶新梢生长期嫩叶葡萄卷叶病毒休眠期成熟枝条韧皮部休眠期成熟枝条韧皮部葡萄锅毒A休眠期叶片、休眠枝条韧皮部休眠期休眠枝条韧皮部葡萄斑点病毒明白生兰现| 依叶休眠期休眠枝条韧皮部5 NY/T 1843-2010 C. 1 总RNA提取附录C(资料性附录)RT-PCR检测l采用二氧化硅吸附法，(1)刮取100mg枝条韧皮部组织放入塑料袋中，加人1mL研磨缓冲液(4.0 mol/L硫氨酸服，O.2mol/L醋酸锅，25mmol/L EDTA, 1. 0 mol/L醋酸饵，2.5%PVP -40，2%偏重亚硫酸纳)磨碎，(2)取500L匀浆置于1.5 mL消毒离心管中(先加入150L10 % N-
12、lauroylsar cosine)，70C保温10min、冰中放置5min后，14000 r/ min离心10min , (3)取300L上清液，加入150L 100%乙醇、300L6 mol/L腆化锅、30L10%硅悬浮液(pH2.0)，室温下振荡20min, (4) 6000 r/min离心1min，弃去上清，加入500L清洗缓冲液(10.0mmol/ L Tris-HC1 , pH7. 5, 0. 5 mmol/ L EDTA, 50. 0 mmol/L NaCl，50%乙醇)重悬浮沉淀，6000r/min离心1min, (5)重复步骤(4)，(6)将离心管反扣在纸巾上，室温下自然干燥
13、后，重新悬浮于元RNasc和DNasc的水中，70C保温4min，(7)130r/min离心3min，取上清液，保存于70C超低温冰箱中。C. 2 合成cDNA5L总RNA与1Lo. 1g/L随机引物5但NNNNNN)3和9L水混合，95C变性5min后立即置于冰中冷却2min。再加入含5L5XMLV-RT缓冲液、1.25L 10 mmol/L dNTPs、O.5L 200 U/L M-MLV反转录酶和3.25L灭菌纯水的反转录混合液，经37C10 min、42C50 min、70C5min合成cDNA。C. 3 PCR扩增PCR反应混合液共25L，包括2.5L cDNA、2.5L10 XPCR缓冲液、O.5L 10 mmol/ L dNTPs、O.5L 10mol/L互补引物、0.375fLL 2U/ J1L Taq DNA聚合酶、18.125fLL灭菌纯水。PCR反应条件根据各组引物的退火温度及扩增产物大小设计。C. 4 结果判定检测时设阴、阳对照，采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物，观察到与阳性对照相同的目的条带的样品为阳性，带病毒，与阴性对照一样，未观察到目的条带的样品为阴性，无病毒。6
