1、ICS 07.100.20 C 51 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 28229-20门入出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检验方法Detection of diarrheagenic Escherichia coli in ballast water of entry-exit ships 2011-12-30发布数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-05-01实施发布中华人民共和国国家标准入出境船翩压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检验方法GB/T 28229 2011 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西
2、城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销唔开本880X12301/16 印张O.75 字数17千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷争6书号:155066. 1-11510定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28229-2011 目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准修改采用美国食品和药物管理局(FDA)(细菌学检验手册:致泻大肠埃希民
3、菌)(2009年7月)(BAM: Diarrheagenic Escherichia coli , uly 2009)。本标准与FDA方法的主要区别是:一一删除部分毒力因子检测步骤;-一一删除实时定量PCR初筛步骤;一培养温度由35.C :1: 0.5 .C修改为36.C士1.C。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国检验检疫科学院归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广州出入境检验检疫局。本标准主要起草人:王林、张顺合、常林、李俊成、张乐、李金有、李德昕、聂维忠、廖如燕、陈春田、慈颖、刘恩东、韩辉。I 1 范围入出境船舶
4、压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检验方法GB/T 28229-2011 本标准规定了入出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌(diarrheager山Escherichiacoli)的检测程序和方法。本标准适用于人出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检测。2 定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 致泻大肠埃希氏菌diarrheagenic Escherichia coli 大肠埃希氏菌属中一部分致病性强、能导致腹泻、与人类疾病有关的菌株统称，通常包括肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、肠侵袭性大肠埃希民菌(EIEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)等。3 设备和材料3.
5、 1 冰箱:2oC8 oC。3.2 恒温培养箱:36oC士1oC ,44 oC士1oC。3.3 过滤集菌装置。3.4 紫外灯=波长365nmo 3.5 元菌锥形瓶:500mL。3.6 元菌移液管:25mL，精确到0.1mLo 3. 7 移液器:0.1mL，精确到0.01mL。3.8 接种环。3.9 接种针。3. 10 元菌培养皿:90mm。4 培养基和试剂。4. 1 脑心浸液肉汤(BHD。4.2 双倍膜蛋白陈磷酸盐肉汤(dTP):见A.104.3 EHEC增菌肉汤(EEB):见A.20 4.4 伊红美蓝琼脂(EMB):见A.3。4.5 麦康凯琼脂(MAC):见A.401) 建议使用商品化培养基
6、和生化反应管以保证质量稳定，生化反应也可使用微生物自动生化鉴定设备完成。GB/T 28229-2011 4.6 改良山梨醇麦康凯培养基(TC-SMAC):见A.504. 7 月桂基硫酸盐膜蛋白陈MUG肉汤(LST-MUG):见A.6。4.8 三糖铁琼脂(TSD:见A.7或A.8。4.9 生化反应管:阿拉伯糖、尿素、呵|噪(蘸基质)、MP/VP、拧棱酸盐、半乳糖昔(ONPG)。4.10 肠致病性大肠埃希氏菌诊断血清。4. 11 肠出血性大肠埃希氏菌诊断血清。4.12 肠侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清。4.13 肠产毒性大肠埃希氏菌诊断血清。5 检测程序致泻大肠埃希氏菌检测程序见图10集菌滤膜+250
7、时，BHI检样集菌滤膜集菌滤踉+250mLEE 图1致泻大肠埃希氏菌检测程序2 GB/T 28229-2011 6 操作步骤6. 1 准备以元菌操作分别抽滤1L压舱水样两份，取集菌滤膜备检。6.2 增菌6.2.1 以元菌操作取1份集菌滤膜加入到250mL的脑心浸液肉汤(BHI)中，振荡混匀，于36.C:!: 1 .C培养3h，加入250mL双倍膜蛋白脏磷酸盐肉汤(dTP)，渥匀后于44.C:!: 1 .C培养18h24 h。6.2.2 以无菌操作取1份集菌滤膜加入到250mL的EHEC增菌肉汤(EEB)中，于36.C:!: 1 .C振荡培养18h24 h。6.3 分离6.3. 1 挑取BHI-
8、dTP增菌液划线接种于伊红美蓝琼脂(EMB)和麦康凯琼脂(MAC)，于36.C士1.C 培养18h24 h后，观察菌落。典型商落在伊红美蓝琼脂上呈黑色扁平南落，大部分有金属光泽，在麦康凯琼脂上呈红色或粉红色。6.3.2 挑取EEB增菌液涂布改良山梨醇麦康凯琼脂CTC-SMAC)，于36.C土1.C培养18h24 h后观察菌落。典型菌落呈淡褐色中心，扁平透明，直径约1mm2 mm。6.3.3 自TC-SMAC上挑取数个典型菌落，分别接种伊红美蓝琼脂(EMB)和月桂基硫酸盐膜蛋白陈MUG肉汤(LST-MUG).EHEC在EMB上的典型菌蔼同6.3.1，LST一MUG培养液置于365nm长波紫外灯下
9、元荧光。6.3.4 若多个选择性培养某均未发现可疑菌落，出具未检出报告。6.4 生化试验自多个选择性平板上挑取5个以上可疑菌落接种三糖铁琼脂(TSI)，接种时使用接种针先穿剌至底部，而后于斜面作划线，于36.C士1.C培养20h;同时进行染色镜检和其他生化鉴定，包括阿拉伯糖、尿素、巧|跺(蘸基质)、MR/VP、拧棱酸盐和半乳糖昔(ONPG)。大肠埃希民菌是革兰氏阴性短杆菌，在TSI底部产酸呈黄色，不产生硫化氢(HzS)，其他生化鉴定特征见表1.阿拉伯糖+ 注:+阳性，阴性。6.5 血清学试验尿素表1大肠埃希氏菌鉴定特征呵|味十或一MR/VP试验+/ 拧棱酸盐ONPG + 综合以上试验结果，挑取
10、经初步生化鉴定出的大肠埃希氏菌落，用肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌诊断血清做凝集试验，根据致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群(见表2)判定致泻大肠埃希氏菌的种类。3 GB/T 28229-2011 表2致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群致泻大肠埃希氏菌的种类包括的O抗原群018a 020a 026 028ac 044 055 086a O1 11a 0114 0119 0125a 0126 0127 EPEC 0128a 0142 0158 0159 ETEC 06 08 011 015 020 025 027 063 078 0128 01
11、48 0149 0159 0167 EIEC 028ac 0112a 0124 0136 0143 0144 0152 0167 EHEC 0157 6.6 报告结果报告每升水样中未检出或检出致泻大肠埃希氏菌和种类。4 A.1 双倍膜蛋白陈磷酸盐肉汤(dTP)A. 1. 1 成分膜蛋白陈磷酸氢二饵磷酸二氢饵氧化铀吐温80蒸馆水A. 1.2 制法附录A(规范性附录)培养基和试剂20 g 2 g 2 g 5 g 1. 5 mL 500 mL 以上成分溶解于蒸锢水后，121.C高压灭菌15min，pH约7.0。A.2 EHEC增菌肉汤(EEB)A. 2.1 基础成分膜蛋白脏、大豆蛋白陈拭化铀磷酸氢二
12、饵葡萄糖3号胆盐磷酸二氢锦蒸锢水A.2.2 抗生素溶谊头抱克后(cefiximc)头抱磺陡(cefsulodin) 万古霉素(vancomycin) 17 g 3 g 5 g 2.5 g 2.5 g 1. 5g 1. 5g 1 000 mL 0.05 mg 10.00 mg 8.00 mg 分别溶于5mL去离子水，经0.22m滤器过滤除菌，备用。A. 2. 3 制法GB/T 28229-2011 基础成分溶解于蒸馆水中，121.C高压灭菌15min，pH约7.4，冷却至50.C左右加入抗生素溶液，混匀备用。5 GB/T 28229-2011 A.3 伊红美蓝琼脂(EMB)A. 3.1 基础成分
13、蛋白陈磷酸氢二饵琼脂蒸情水A.3.2 其他成分20%乳糖2%伊红Y溶液0.65%美蓝溶液分别过滤除菌，备用。A.3.3 制法10 g 2 g 17 g 1 000 mL 50 mL 20 mL 10 mL 基础成分溶解于蒸馆水中，121.C高压灭菌15min，pH约7.1，冷却至50.C左右，加入乳糖、伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。A.4 麦康凯琼脂(MAC)A. 4.1 基础成分蛋白陈17 g 陈3 g 3号胆盐1. 5g 氧化铀5 g 琼脂17 g 蒸馆水1 000 mL 乳糖10 g 0.01%结晶紫水溶液10 mL 0.5%中性红水溶液5 mL A.4.2 制法将以上成分加热溶解于蒸
14、馆水中，121.C高压灭菌15min备用，pH7.2，冷却至50.C左右倾注平板。A.5 改良山梨醇麦康凯培养基(TC-SMAC)A.5.1 成分6 蛋白陈多蛋白陈山梨醇17.0 g 3.0 g 10.0 g 胆盐氯化铀琼脂中性红结晶紫蒸馆水A.5.2 制法1. 5g 5g 13.5 g 0.03 g 0.001 g 1000 mL G/T 28229-2011 将以上成分加热溶解于蒸锢水中，121.C高压灭菌15min, pH 7.1，冷却至50.C左右倾注平板。A.6 月桂基疏酸盐原蛋白朦MUG肉汤(LST-MUG)A. 6.1 成分膜示陈乳糖磷酸氢二饵磷酸二氢饵氯化铀十二皖基硫酸铀4甲基
15、伞形酣-卢D葡萄糖醒酸背MUG蒸馆水A.6.2 制法20 g 5 g 2.75 g 2.75 g 5 g O. 1 g 50 mg 1 000 mL 将以上成分加热溶解于蒸馆水中，pH约6.8，分装到试管中，每管10mL, 121 .C高压灭菌15min. A.7 三糖铁琼脂(TSOA. 7.1 成分蛋白陈20 g 牛肉音5 g 乳糖10 g 庶糖10 g 葡萄糖1 g 氧化铀5 g 硫酸亚铁镀0.2 g 硫代硫酸铀0.2 g 琼脂12 g 酣红0.025 g 蒸馆水1 000 mL A.7.2 制法将以上成分溶解于蒸馆水中，pH约7.3，1l8.C高压灭菌15min。分装试管，装量宜多些，以
16、便得=ON-mNNNH阁。GB/T 28229-2011 到较高的底层，制成高层斜面备用。三糖铁琼脂(替代方法)A.8 15 g 5 g 3 g 3 g 10 g 10 g 1 g 5 g 0.2 g 0.3 g 12 g 0.025 g 1 000 mL 成分蛋白陈示陈牛肉音酵母膏乳糖煎糖葡萄糖氧化铀硫酸亚铁硫代硫酸铀琼脂酣红蒸馆水A. 8.1 制法将以上成分溶解于蒸馆水中，加热溶解，pH约7.40121 oC高压灭菌15min，分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层，制成高层斜面备用。A.8.2 侵权必究3峰书号:155066 1-44540 定价:版权专有16.00 )l; GB/T 28229-2011 打GPH期:2012年4月12H F002A
