1、Ics 67050X 04 囝园中华人民共和国国家标准GBT 23504-2009食 品中 玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法Determination of zearalenone in food-High performanceliquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup1009一04一08发布 2009050 1实施中华厶民共jH国国家质量监督检验检疫总局辔士中国国家标准化管理委员会厦仲前 言GBT 23504-2009本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国食品工业标准化技术委员会(SAC
2、TC 64)提出。本标准由全国食品工业标准化技术委员会食品通用检测技术分技术委员会(SACTC 64SC 8)归口。本标准起草单位：青岛市产品质量监督检验所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中检维康技术有限公司、青岛啤酒股份有限公司。本标准主要起草人：张辉珍、董建军、吕宁、李宏伟、李惠颖、翟士星、王雄。食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法GBT 23504-20091范围本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮含量的免疫亲和层析净化高效液相色谱测定方法。本标准适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮含量的测定。本标准的方法检出限：粮食和粮食制品的检出限为20
3、pgkg，酒类的检出限为20 pgkg，酱油、醋、酱及酱制品的检出限为50 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3方法提要用提取液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所
4、用试剂均为分析纯，水为符合GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43提取液：乙腈+水(9+1)。44 PBS清洗缓冲液：称取80 g氯化钠、12 g磷酸氢二钠、02 g磷酸二氢钾、02 g氯化钾，用990 mL水将上述试剂溶解，然后用浓盐酸调节pH至70，再用水定容至1 L。45玉米赤霉烯酮标准品；纯度98。46玉米赤霉烯酮标准储备液：准确称取一定量的玉米赤霉烯酮标准品，用甲醇+乙腈(1+1)溶解，配成01 mgmL的标准储备液，在-20保存，可使用3个月。47玉米赤霉烯酮标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的玉米赤霉烯酮储备液，用流动相稀释，分别配成相当于10
5、 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、500 ngmL的标准工作液，4保存，可使用7 d。48玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。49玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径15xm，无荧光特性。5仪器和设备51天平：感量0001 g。52高效液相色谱仪：配有荧光检测器。53均质器：转速大于10 000 rrain。1GBT 23504-200954高速万能粉碎机：转速10 000 rrain。55玻璃注射器：lo mL。56试验筛：1 mm孔径。57空气压力泵。6分析步骤61试样制备与提取611粮食和粮食制品：将样品研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛(56)，不要磨成
6、粉末。称取50 g(精确到001 g)磨碎的试样于100mL容量瓶中，加入5 g氯化钠，用提取液(43)定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2 min。定量滤纸过滤，移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。612酒类：取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类使用前先置于4冰箱冷藏30 rain，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20 g(精确到001 g)于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B
7、于干净的容器中。613酱油、醋、酱及酱制品：称取25 g(精确到001 g)混匀的试样，用乙腈定容至i000 mL，超声提取2 rain，定量滤纸过滤，移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液c于干净的容器中。62净化将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(55)下，准确移取6i中的滤液A或B或CIO0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。依次用10mL PBS清洗缓冲液(44)和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴s2滴s，直至空气进入亲和柱中，弃去
8、全部流出液，抽干小柱。63洗脱准确加入10 mL甲醇洗脱，流速约为1滴s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容至1 mL，HPLC测定。64高效液相色谱参考条件a) 色谱柱：C1s柱，5 pm，150 mm46 mm或相当者；b)流动相：乙腈+水+甲醇(46+46+8)；c)流速：10 mLmin；d)柱温：35；e) 进样量：20 pL100 pL；f)检测波长：激发波长274 rim，发射波长440 Tlm。65定量测定以玉米赤霉烯酮标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作由线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中玉米赤霉烯酮的响应值均应在仪
9、器检测线性范围内。在上述色谱条件下，玉米赤霉烯酮标准品色谱图参见图A1。66空白试验除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。67平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7结果计算试样中玉米赤霉烯酮的含量按式(1)计算2(c1一co)V1 000m1 000GBT 23504-2009式中：x试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克(pgkg)；旬试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；Co空白试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL)；m试样的质量，单位为克(g)；，稀释倍数。检测结果以两次测定值的算术平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。8回收率添加浓度在50 pgkg200 pgkg时，回收率在70100之间。9重复性在重复性条件下，获得的玉米赤霉烯酮的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的10。GBT 23504-2009附录A(资料性附录)玉米赤霉烯酮标准品的液相色谱图图A1 玉米赤霉烯酮标准品的液相色谱图0O0OOO2O86屯曩
