1、ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 19180-2003 牛海绵状脑诊断技术Diagnostic techniques for bovine spongiform encephalopathy 2003-06-04发布中华国家质人民共和国监督检验检瘟总局2003-12-01实施发布275 GB/T 19180-2003 前言牛海绵状脑病是动物传染性海绵状脑病的一种，对动物和人有着持久性危害并最终致死，世界动物卫生组织(IE)将之列为B类动物疫病，我国将其定为一类动物疫病。本标准是依照。IE的诊断试验和疫苗标准手册以2000年版)( Manual 01 Standar
2、ds for Diag nostic Tests and Vaccines)2000)第2.3. 13章关于牛海绵状脑病的诊断技术规定制定的。本标准与该文件的差异是2本标准中除症状描述(临床诊断)外，采用该文件规定的两项主要技术即组织病理学诊断和免疫组织化学诊断技术，其他推荐技术未采用;由于该手册对上述两项技术的具体操作程序未作规定，本标准采用了OJE传染性海绵状脑病瑞士参考实验室(OIETSE Relerence Laboratory, Institute 01 Animal Neurology, Universi ty 01 Bern，Switzerland)的操作程序g本标准在文字表述上
3、按照GB/T1. 1-2000(标准化工作导则第1部分标准的结构和编写规则规定和汉语习惯编写。本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位g农业部动物检疫所。本标准主要起草人z王志亮、刘雨田、邹艳丽、玉树双。276 GB/T 19180-2003 牛海绵状脑病诊断技术1 范围本标准规定了诊断牛海绵状脑病CBSE)的技术要求。本标准适用于牛海绵状脑病的诊断g也可用于其他动物的传染性海绵状脑病(TSE)的诊断。2 临床诊断BSE病牛临床症状各种各样，病程多为数月至一年，最终死亡。当病牛出现以下全部或部分症状而
4、又不能确定为其他疾病时，应怀疑BSE的可能。2. 1 行为异常表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁，不自主运动，如磨牙、震颤;不愿接触水泥地面或进入畜栏等。2.2 感觉或反应过敏表现为触、视、听三觉过敏。对颈部触摸、光线的明暗变化以及外部声响过度敏感，这是BSE病牛重要的临床表现。2.3 运动异常病牛步态呈鹅步状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。2.4 体量和体况体重和体况下降。其他动物的TSEI临床症状不尽相同，但确诊应依靠实验室诊断。3 实验室诊断发现可疑病例后，应进行采样，送专门实验室检测。3. 1 采样将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。用剪
5、刀剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑。大规模监测时，可用专用工具从枕骨大孔处，取出延脑部分即可。3.2 固定将完整的脑组织浸入10倍体积的固定液(配方见附录A)中国定。一周后更换固定液，再维持一周。3.3 组织病理学诊断3. 3. 1 病料处理3.3. 1. 1 把固定好的脑组织取出，将大脑和小脑去除，横切脑干选取厚度为3mm5 mm的脑问部延髓、小脑后脚部延髓和前丘部中脑组织块。3. 3. 1. 2 将选取好的组织块放入新配的固定液中再固定一周，其间更换固定液三次，并用水平摇床不断摇荡，以提高固定液的渗透力。3. 3. 1. 3 将固定好的组织块放人流水中漂洗24h。3. 3
6、. 1. 4 放入下列不同浓度的酒精中脱水=a) 75%酒精中2h; b) 85%酒精中2h; c) 95%酒精I中2h; 277 GB/T 19180-2003 d) 95%酒精H中2h; e) 100%酒精I中2h; f) 100 %酒精H中2ho 3.3.1.5 放入下列香柏油和二甲苯中透明:a) 香柏油中12h; b) 二甲苯I中1h, c) 二甲苯E中1人3. 3. 1. 6 按下述方法浸蜡:a) 软蜡中40min; b) 硬蜡中2ho 3. 3. 1. 7 将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，冷却过夜。3.3.1.8 将石蜡块切成5m厚的切片，用干净的载玻片贴片。3. 3. 1
7、. 9 烤片24h以上。3.3.2 H-E染色3.3.2.1 试剂配制z见附录B。3.3.2.2 操作步骤如下a) 二甲苯I中10min; b) 二甲苯H中10min; c) 100%酒精I中2rnin; d) 100%酒精H中2min; e) 95%酒精I中2min; f) 95%酒精H中2min; g) 85%酒精中2min; h) 75%酒精中2min; 自来水洗2min; j) 哈里斯酸性苏木精12min; k) 自来水漂洗2min; l) 酸性酒精10S; m) 自来水漂洗5min; n) 饱和碳酸铿蓝染30S; 。)自来水漂洗10min; p) 75%酒精中2min; q) 85%
8、酒精中2min; r) 95%酒精伊红液中复染1min; s) 95%酒精中2min; t) 100%酒精I中2min; u) 100%酒精E中2min; v) 二甲苯I中2min; w) 二甲苯H中2mino 3.3.3 用中性树胶封片3.3.4 结果观察在光学显微镜下(10X 10 .10 X 40)观察切片，若被检样品脑干灰质区特别是脑问部位的孤束核、迷走神经背核、三叉神经脊束核等处的神经元核周质或神经纤维网胞浆中出现双侧对称性海绵状空泡病278 GB/T 19180-2003 变，且空泡呈规则的圆形或椭圆形，周边整齐，则可判定为BSE感染。在正常情况下，动眼神经核和红核处的核周质也可能
9、有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应注意区别。若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变，则用免疫组织化学方法做进一步诊断。3.4 免瘦组织化学诊断3. 4. 1 固定病料的处理间3.3. 1. 3.4.2 试剂配制见附录C，3.4.3 操作方法3.4.3.1同3.3.2.2 a)i)。3. 4. 3. 2 PBS洗三次，每次5min。3.4.3.3 将蛋白酶K缓冲液水浴至37C，加入蛋白酶K，并立即将切片放人，确保切片全部浸入，消化15 min, 3.4.3.4 在一个不锈钢饭盒中倒入刚煮沸的蒸馆水，并立即将切片放人盒中，确保切片完全浸入水中，盖好盒盖，在121C(约103kPa)条件下高压
10、蒸汽处理20min，然后自然冷却。3. 4. 3. 5 PBS洗三次，每次5mino 3.4.3.6 甲醇双氧水中室温处理5min。3. 4. 3. 7 PBS洗三次，每次5mn。3.4.3.8 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加5%的正常猪血清，确保组织全部覆盖，放人湿盒中室温作用20rnino 3.4.3.9 将切片放人1: 800稀释的兔抗牛PrP抗体溶液中，确保切片完全浸入，37C作用4h。也可用1: 1000的兔抗牛PrP抗体溶液37C过夜处理。3.4.3. 10 PBS洗三次，每次5rnino 3.4.3.11 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切
11、片上滴加DAKO试剂盒(见第C.6章)中BottleA的溶液，确保组织全部覆盖，放入湿盒中室温作用10min。3.4. 3. 12 PBS洗三次，每次5min 3.4.3.13 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加DAKO试剂盒中BottleB 的溶液，确保组织全部覆盖，放入湿盒中室温作用10mino 3.4.3.14 PBS洗三次，每次5min。3.4.3.15 将切片在蒸馆水中放1min-2 min 3.4.3.16 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加DAKO试剂盒中BottleC 的溶液，确保组织全部覆盖，放入湿盒中室温作用5min 10 min
12、o 3.4.3.17 将切片在蒸馆水中放1mn-2 min。3.4.3.18 以专用封片剂封片。3.4.4 结果判定在光学显微镜下(10X 10 , 10 X 40)观察切片，结果判定如下a) 阳性结果z在阳性对照切片染色结果正确的条件下，若被检样品脑干灰质区特别是脑问部位的迷走神经背核、孤束核和三叉神经脊束核等处出现双侧对称性紫红色染色颗粒，JilU 主样品判为BSE阳性。b) 阴性结果z若被检样品脑干灰质区未出现紫红色染色颗粒，则判为BSE阴性。279 G/T 19180-2003 氯化纳蒸馈水40%福尔马林混匀即可。附录A(规范性附录)固定液10%揭尔马林生理盐水固定液的配制8.5 g
13、900 mL 100 mL 附录B(规范性附录)组织病理学诊断(H-E染色)的试剂配制. 1 晗里斯殴性苏木精染液. 1. 1 配方苏木精1. 0g 无水乙醇10 mL 蒸馆水200 mL 氧化*0.5 g 冰乙酸8 mL 御明矶20.0 g . 1. 2 配法先将苏木精溶于元水乙醇，然后将何明矶和蒸馆水煮沸溶化，去火速加人苏木精元水乙醇溶液中，再去火，立即加入氧化乘煮沸，迅速冷却后加入冰乙酸，过滤使用。.2 酸性酒精在100mL的70%或80%酒精中加入0.5mL或1mL的浓盐酸.3 碳.锺饱和水溶液碳酸铿2g加100mL蒸馆水，充分溶解。.4 95%酒精伊红液伊红0.5g加入100mL95
14、%酒精中配制。280 C.l 蛋白酶K缓冲溶液C. 1. 1 配方1 mol/L Tris-HC1(pH8. 0) O. 1 mol/L CaCl, 蒸馆水C. 1.2 配法GBjT 19180-2003 附录C(规范性附录)免瘦组织化学诊断的试剂配制2.5 mL 0.75 mL 47 mL 先将Tris-HCl、CaCl，和蒸馆水混匀。用前在37C水浴中加入蛋白酶K(7L)。C.2 甲醇双氧水(使用前5min配)甲醇H,O,(30%) C.3 0.1 mol/L PBS(pH7.4) 50 mL 1. 5 mL NaCl 8 g KCl 0.2 g Na, HPO, 1. 44 g KH2
15、PO, O. 24 g 加水800mL溶解，调pH至7.4，加水至1000 mLo C. 4 5%正常猪血清(NSS)。1PBS(pH7. 4) NSS C.5 兔抗牛PrP抗体(或PrP单克隆抗体)1 800的稀释溶液(或PrP单克隆抗体)PBS(pH7.4) 兔抗牛PrP抗体1 1000的稀释溶液(或PrP单克隆抗体)PBS(pH7.4) 兔抗牛PrP抗体C. 6 DAKO ChemMate Detection Kitj AEC BottleA，生物素标记的抗鼠和抗兔免疫球蛋白BottleB，亲和素辣根过氧化物酶结合物llottleC , AECjH, 0，底物搭液4 mL 200L 50 mL 62.5L 50 mL 50L 281
