1、GB/T 17999.21999 前 1=1 牛二标准参照美国SPAFAS公司的血清中和1试验(SN)操作规程编制而成。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监视l总则和9种SPFx鸟微生物学检测方法。本标准为(SPF鸡血清中和试验。SPF码1.世生物学检测方法还包括以F部分:GB/T 179. 1 - 1999 SPF鸡红细胞凝集抑制j试验;GB/T 17999.3 1999 SPF鸡血清平板凝集试验;GB/T 17999.4 1999 SPF，电玉在脂扩散民验JGB/T 179甘9.5- 1999 SPF 鸟酶耳其免疫吸附试验，GB/T 1799J. 6-199D SP
2、F x电胚敏感试验;GB/T 17999.7 -1999 SPF鸡鸡白荆沙门氏菌检验，GB/T 1799D. 8 1日9)SPF鸡试管凝集试验，GB/T 17999.9 1999 SPF鸡间接免疫荧光试验。中;标准ll11 I华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准山农业部畜牧兽民百j归门。本标准起草单位农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准仨要起草人:赵立幻、陈德威、张秀美、秦卓明。中华人民共和国国家标准SPF鸡血清中和试验GB/T 17999.2 1999 SPF chicken -Serum neutralization test 1 范围本标准规定了血清中和试验所
3、用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用rSPF鸡感染以下病毒后的中和抗体的监测:禽脑脊髓炎病毒(AvianEn cephalomyelitis Virll川、传染性支气管炎病毒OnfectiousBronchitis Virus)、传染性喉气管炎病毒(lnfe口iousLaryngotracheitis Virus)、传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursal Disease Virus)。2 原理巾和试验系指有生物1i性的病毒与相应的抗体结合后，可失去原有的生物活性的中和反应。中和反应不仅布高度特异性，且具有严格的量的关系。因此可用中和试验鉴定病毒，也可用于相应抗体的定量检
4、测。3 试剂和器材3- 1 试剂3- 1. 1 ;_fi内际磷酸肉汤。3.1.2 肯霉素/链霉素(双抗)液。3- 1.3 3%硕溶液。3- 1.4 SPF ,IL 3- 2 器材3- 2. 1 蚤钻(打孔器)。3- 2. 2 6辛|头。3- 2.3 7针头。3- 2. 4 混合器。3- 2. 5 照蚤器。3.2.6 常规实验设备。4 操作程序4. 1 试验准备4. 1. 1 血清样品处理被检血清和阳性对照血清经56C 30 min45 min灭活，保存于20 C条件F备用。4. 1. 2日PF蛋准备4.1.2.1 共需12枚蛋。4.1.2.2 照蛋检查胚体活力，试验只用健康胚。41. 2. 3
5、 根据病毒种类选择接种方法(见表1)。用3%确溶液消毒胚蛋接种部位。国家质量技术监督局1999-11-10批准20-04 -01实施7 t GB/T 17999.2-1999 表I病毒接种胚龄与方法病毒胚龄.d接种方法禽脑脊髓进病毒5-7 YS 传染性支气管世病毒91l CAS 传染性法氏囔病病毒10 CAM 传染性喉气管炎病毒91l CAS 注YS卵黄囊，CAS尿囊腔CAM绒毛尿囊膜。4. 1. 3 稀释病毒4.1. 3. 1 取灭菌试管4支9支，每管1m入稀释液4mL，青霉素/链霉素液0.5mL。4.1. 3. 2 ;在l管加入病毒液。.5mL，作连续10倍稀释。各种病毒的稀释度参照表2，
6、表2病毒稀释病毒禽脑脊髓炎病毒传染性主气管世病毒传染性法氏囊病病毒传染性喉气管炎病毒4.2 中和试验4. 2. 1 每份被检血清需).5 mL。4.2.2 病毒稀释度边择稀释度10-1_10-6 10-110-9 10-1-0- 4 10-110-6 根据具体情况决定，一般选择3个连续的病毒稀释度。检测SPF鸡血清样品时，病毒稀释度，采用较高稀释度，如110-610勺检测阳性对照血清样品时，病毒采用较低稀释度，如10-10气检测普通码血清样品时，州毒稀释度常采用10310304.2.3 病毒与血清混合感作将血清与不同稀释度的病毒等量混合后，经室温(l8.C22C)感作，感作时间见表3，表3血清
7、与病毒混合感作时间病毒感作时间，ml自脑脊髓炎病毒60 传染性支气管走病毒30或60传染性法氏囊病病毒60 传染性喉气管世病毒45 4.2.4 接种鸡胚4.2.4.1 病毒与血清混合感作后接种鸡脏，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2mL 0 4.2.4.2 病毒对照:将不同稀释度的病毒液，分别接种鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接种().l mL 4.2.5 孵化将战种后的鸡胚放入孵化器，继续孵化。根据病毒不同，选定不同的孵化时间(见表4)。表4接种鸡胚的孵化时间 病毒孵化时间，d禽H由脊髓炎病毒I 1012 传染性主气管世病毒I 3-4或8传染性法氏囊病病毒| 传且是性喉气管#
8、毛病毒| 4. 2. 6 记录各tf1.死亡鸡脏数，接种禽脑脊髓炎病毒的鸡胚，若胚胎经刺激无反应时，按死亡鸡111记录。72 G8/T 17999. 2- 1999 4.2.7 计算巾和指数结果以中和指数表示，中和指数表示被检血清中有无中和抗体及中和病毒的能力。为求中和指数，应计算出病毒对照和被检血清/病毒的ELD50，此二者的差数即为中和指数(Reed和Muench法)，参见示例。4.2.7.1 示例:病毒对照组及血清/病毒试验组死亡情况见表5和表6。表5病毒对照组死亡情况累计病毒稀辑度死亡比例死亡存活死亡存活死亡比例死亡百分率.%10 3/4 3 1 4 11 4/5 80.0 10 1/
9、4 1 3 1 4 1/5 20.0 10 。14。4 to 8 0/8 。注:分母表示接种鸡胚数，分于表示因病毒感染死亡玛胚数。表6血清/病毒组死亡情况罩i十病毒稀释度死亡比例死亡存活死亡存活死亡比例死亡百分率.%t-10 3/4 3 1 6 11 6/7 86.0 10 7 3/4 3 1 3 2 3/5 60. 0 10- H 。14。4 t 0 6 0/6 。4.2.7.2 中和指数计算:试验组ELD;o效价等于高于50%死亡百分数病毒稀释度倒数的对数加距离比。4.2.7.2.1 距离比按式(1)计算:高于50%的死亡百分数-50距离比1一一一一. ( 1 ) 高于50%的死亡百分数一低于50%的死亡百分数4. 2. 7.2. 2 病毒对照组ELD50效价在10-10-之间80-50 病毒对照组ELD50效价=7+药EB=7十O.5 =7.5 ELD50 = 10-; 4. 2. ? 2. 3 血清/病毒组ELD;o效价在10-7lO-S之间60-50 血清/病毒组ELD;o效价=7+EE=u=7十O.17 (约0.2)=7.2 ELD5o=10-U 4. 2. ? 2. 4 被检血清的中和指数二病毒对照组ELD50效价被检血清/病毒组ELD50效价被检血清中和指数=7.5一7.2三O.3 5 结果判定被检血清的巾和指数二三2.0为阳性。73
