1、GB/T 17999.1 1999 前本标准以我国建立的HI方法为基础，参照美国SPAFAS公司的有关操作规程，规定rSPF鸡红细胞凝集抑制试验。SPF鸡微生物学质壁控制同家系列标准包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测M.去。本标准为(SPF鸡红细胞凝集抑制试验。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分:GB/T J 7999.2-1999 SPF鸡血清巾和试验;GB/T 17999.3- 1999 SPF鸡血清平板凝集试验sGH/T 17999.4 -1999 SPF鸡琼脂扩散试验，GB/T 17999.5-1999 SPF鸡酶联免疫吸附试验;GB/T 17999.6 - 1
2、999 SPF鸡胚敏感试验;GB/T 17999.7-1999 SPF鸡鸡臼病沙门氏菌检验;GB/T J 7999.8 J 999 SPF鸡试管凝集试验;GB/T J 7999.9-1999 SPF鸡间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准向农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位:农收部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准主要起草人:陈德威、赵立红、靳彦华、张秀美、李军。中华人民共和国国家标准SPF鸡红细胞凝集抑制试验GB/T 17999.1 1999 SPF chicken H.magglutination inhibition I.sl 1 范围
3、牛;标准规定红细胞凝集抑制试验所用试开，)、材料，操作程序反结果判定等。木标准适用TSPF鸡感染以下病原微生物后的血凝抑制抗体监测:禽流感病毒(A型)CAvian Jn f1 llcnza VirusCType A).传染性主气管炎病毒OnfectiousBronchitis Viru时，新城疫病毒(NewcastleDi时3CVirus).禽腺病毒E群(减蛋综合i)(Avian Adenovirus Group m).鸣毒支原体(MycoplasmaCallis叩ttrlln仆，滑液挺支)剧本(MycoplasmaSynoviae)。2 原理凶多1，司带H有i疑集zjJ物红细胞的能力.这种凝
4、集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制，因此叮用己n病毒草11则相1I屯的rfn凝抑制性抗体。3 试剂和器材3. 1 试用i3. 1.1 1111凝抗尿。3. 1-2 I饲件、阳性rfili肯。3. 1. 3被f.国惰。3.1.4 句红细胞。3. 1.5 0.8S%生理盐水。3. 1. 6 阿氏液。3. 2 (.，吕材3. 2. 1 96孔微世血凝版刊型)。3.2.2 j:世lLf移液器(TDl(lld_2(10L!坟版头。3. 2. 3 水浴锅uJ 2.4 ItH.、机AJfft形刻!Ei萄心管，4 操作程序4. 1 抗以由I.疑效价测定4.1.1 10%和(.5%鸡红细胞液的制备4.1.1.1
5、 采鸡血:用注射器吸取严I氏液约JmL.取3日龄10日龄SPF鸡(最少两只).从胸骨尖F方fJ 1. :i cm处将注射(，针头刺入心脏.吸取心而1约2mL.l mL.与f氏液轻轻混合，放入装有10mL阿民的内心fT中c4.1.1.2 洗冻Xfl细胞:将离心管中的血液经1SO r /min J 800 rlmin离心8ffim，弃上清液，沉淀物!m入网l;液，轻轻混合后，博士主1500 r/minl 800 r/min 1离心8min.Ill吸管移去u青液及沉淀红细国家质量技术监督局1999-11 -10批准2000- 04 -01实施li GB/T 17999.1-1999 胞，:层的内细胞
6、溥艘，冉重复以t过程后，加入阿氏液20mL，轻轻混合成红细胞悬液，4C:保存5d备用。4. 1.1. 3 10:;，鸡红细胞悬液:取阿氏液保存不起过5d的红细胞液，在锥形刻度离心管中离心1500 r / min1 8D r/min R min.奔去上清液.准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(m!.)的中理盐水.If吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞均匀混合。4.1.1.4 O.5:;，鸡红细胞液:取混合均匀的10:;，鸡红细胞悬液1mL，加入19mL生理盐水，混合均匀即口L4. 1. 2 抗bZIhii饪放价削- 4.1.2.1 J微1怯注而巾11凝疑板的A.G排?各斗孔力加日入
7、生理理盐水50L，H矶与H50L。4.1.2.2 A G排的第l孔加入抗原50L.每种抗原的血凝效价测定应作两排检验，如A，与B，孔各加入新城疫病毒抗原50L;C与0，孔各加入禽流感病毒(A型j)抗原50L.以此类推。4.1.2.3 Jij微量移液苦苦，从第1孔至第12孔对抗原作系列倍比稀释，即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次，I吸H150L移至第2孔，用生理盐水清洗吸头3次后，再用于下一个孔的混合，以此类推，自至第12孔，从第12孔中吸出50L弃去，此孔抗原的最终稀释度为1 4 096。4.1.2.41，f孔巾1m入Q.5 %，与红细胞悬液50JlL，包括H与H12孔。4.1.2
8、.5 将由1凝板fI:振荡器上中速振荡1min_ 2 min 0 4.1.2.6 忧宅温(18C22 C)感作ISmino 4.1.2.7 抗!点j(1凝效价判定感件完毕.观察血凝板，判读结果(见表1)。表1血凝试验结果判读标准问|孔底所见结果1 红细胞全部凝集，均匀铺1孔底，1I100%红细胞凝集+ 2 1 2细胞凝集基本同t.例孔底有大圈+十十3 红细胞ffL底形成中等大的圈，四周有小凝块斗斗4 红细胞于孔Iff形成小圆枝，四周有少许凝集块斗F 红细胞于孔I呈小圆点，边缘光滑整齐.即红细胞完全不凝集能使红细胞完全凝集uoo%凝集，十十十十)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为l个I
9、llL疑单位。l一意对照、孔hli_呈现完全不凝集(-)，否则此次检验无效。4.2 的L凝州!制试验4. 2. 1 被检血清样品准备4.2.1.1 m消灭活:被枪血清，包括阳性、阴性血清.56C水浴30min-45 min，以破坏补体及血凝抑制I址f。4.2.1.2 血惰的鸣吉l细胞吸收z检测禽腺病毒皿群(EOS)时.分别吸取被检血清与对照血清样品30( I, L t试管!, 1m入10%鸡红细胞悬液300L，轻轻混匀，室温(l8C22C)感作30min，离心2 500 r /min 10 min , j:血清稀释度为1 2 , 4. 2. 2 抗原I!备竹，血凝抑制试验I!才各种抗原所用血凝
10、单位:禽流感病毒(A型)8个与4个血凝单位传染性支气管发病毒8个j4个血凝单位新城疫病毒16个与8个血凝单位禽腺病毒E群8个与4个血凝单位鸡毒支原体8个与4个副l凝单位滑液fi以体8个与4个血凝单位(;民GB/T 17999.1-1999 8个血凝单位抗原的配制:如果某抗原的血凝放价为1, 1 024，8个血凝单位为124/8 128(即1128)，取生理盐水11.8 mL. 1m入1 10稀释的抗原1.0 mL，混合均匀即为1, 128稀释液c4.2.3 抗原血凝效价的重测定4.2. 3- 1 为了确i止血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对己配制的8个血凝单位抗原进行血凝效价的再测定，此项
11、试验常与血凝抑制试验同时进行。4. 2. 3- 2 A至H各排第1孔分别加入100L8个1m凝单位抗原(新城疫病毒抗原也hu8 、血凝单位抗原，不要加16个血凝单位抗原)。4.2. 3- 3 各排第2吕孔各加生理盐水50!止。4.2.3.4 将抗原分别作系列倍比稀释至第8孔，从第8千L吸50L弃去。4.2. 3- 5 每孔1m0.5%鸡红细胞悬液50L，4.2. 3-6 将血凝板I.微量振荡器t中速振荡1miw- 2 rnn 4.2.3.7 室温(18C22C)感作45mm左右。4.2. 3- 8 观察结果，若血凝单位偏离两个以上稀释度，回lIl;疑抑制1飞机兄放(iIll凝单位偏离1个稀释j
12、主.属可校正范闸，按常规对被检血清的血凝抑制效价进行佼.Li. 4.2.4 血凝抑制试验4.2.4.1 血凝极每排检测一份被检血清。第1孔分别加入经鸡红细胞l吸收过的被t:n!n.奇40L.再加入U理盐水6011L;或加入其他未经红细胞l吸收过的被拉血清201;. il hn入十理盐水()11.，每孔的总体积为100L.被检血清稀释度为1, 5 , 4.2.4.2 设阳性血清与阴性血消对照。4.2.4.3 每排第2孔分别加入50fJ.L8个单位抗原(新城疫病毒.j50 I，Ll6个血凝单位抗原)，第3II 孔加50IA个单位抗原(新城疫病毒为50I，L8个单位抗原)4.2.4.4 用移液器自第
13、HL吹吸3次后，取d:;)0 flL 移第2孔.以此(iV比稀特卡第11L，从11孔吸出50flL弃去。4.2.4.5 第l孔为血清对照，第2孔被检血清为1 10稀释，第3孔1 20，寄4.孔1, 40，以此类推，第11孔为1 5 120。4.2.4.6 每孔加入0.5%鸡红细胞悬液50L，4.2.4.7 将血凝板过微量振荡器上振荡1miw- 2 ffilIl 0 4.2.4.8 i可室温(18C22C)感作45min左右。4.2.4.9 感作完毕，将血凝饭倾斜700，凡沉淀F孔底的红细胞沿倾斜l丽I;JF呈线状流动，呈现弓红细胞对照孔-样将为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度:h吟、被检血清血凝抑制效价。5 结果判定禽流感(Ali)、新城疫、传染性支气管发、禽腺病毒田群(EDS)的曲l清血凝抑制效价;江1 1 0为阳饨，鸡毒支原体、滑液囊支l才、休的血清血凝抑制议f:; I :白。为阳性。
