1、中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法绿脑杆菌Standard methods of microbiological examination for cosmetics Pseudomonas aeruginosa UDC 668. 58 576 . 85. 07 GB7918.4 87 绿服杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化服感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿腋抨菌1 方法提要根据本菌生物学特征2革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿朦菌素。此外还能液化明肢，还原硝
2、酸盐为亚硝酸盐，在42条件下生长等，可与类似菌相区别。2 培弊基和试J2. l SCDLP液体培养基见GB79!8.J87化妆品微生物标准检验方法总则儿2. 2 十六烧三甲基澳化镀培养基成分z牛肉膏3g 蛋白陈!Og 氯化销十六烧三甲基澳化镀琼脂蒸馆水5g o. 3g 20g !OOOml 制法z除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4 7. 6 .加入琼脂，！15C(!Olb)20min灭菌后，制成平板备用2. 3 乙酷胶培养基成分z乙酷胶氯化饷无水磷酸氧二饵无水磷酸二氢饵JO. Og 5. Og J. 39g o. 73g 硫酸续（MgS0, 7 H, 0) 0. 5g 盼红o.
3、012g 琼脂20g 蒸馆水I OOOml 制法除琼脂和盼红外，将其他成分加到蒸馆水中，加热溶解，调pH为7.2.加入琼脂、盼红，121c 中华人民共和国卫生部198705 28批准1987 10-01实施j 43 GB7918.4 87 (15 lb)20 min离压灭菌后，制成平板备用2. 4 绿隙菌色素测定用培养基成分z蛋白陈20g 氧化镇I. 4g 硫酸饵lOg 琼脂l8g 甘泊化学纯）lOg 蒸馆水lOOOml 制法z将蛋臼陈、氯化模和硫酸饵加到蒸馆水中加温使溶解，调pH至7.4 .加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115（10lb)20 min高压灭菌后，制成斜面备用。2.
4、5 明胶培养基成分牛肉膏3g 蛋白陈Sg 明胶120g 蒸偏水I OOOml 制法z取各成分加在蒸锢水中浸泡20min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4.分装于试管内经115（10 lb)20 min灭菌后，直立制成高层备用2. 6 硝酸盐蛋白陈水培养基成分g蛋白腺lOg 醇母浸膏3g 硝酸梆2g 亚硝酸饷0. 5g 蒸馆水lOOOml 制法将蛋白陈和酵母浸膏加到蒸偏水中，加温使溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸侨和亚硝酸俐，浴解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115（10lb)20 min灭菌后备用2. 7 普通琼脂斜面培养基成分2蛋白陈!Og 牛肉膏3g 氯化销5g 琼脂
5、15g 蒸馆水lOOOml 制法z除琼脂外，将其余成分溶解于蒸偏水中，调pH为7.2 7. 4，加入琼脂加热溶解，分装试管，121（ 15 lb) 15 min高压灭菌后，制成斜面备用。5仪器3. 1 培养箱，37、423. 2 锥形烧瓶。3. 3 试管。3. 4 灭菌平皿。3. 5 灭菌刻度吸管。3. 6 显微镜，3. 7 载玻片。3. 8 接种针、接种环。144 GB 7 9 1 8 . 4 - 8 7 3, 9 电炉3, 10 高压消毒锅。4 操作步骤4, 1 增菌培养z取1 10样品稀释液！Om！加到90mlSCDLP液体培养基中，置37培养1824h.如有绿版杆菌生长，培养液表团多有
6、一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色注2如元SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基幢验吉防腐剂的化妆品时，在每1000ml普通肉汤中加lg卵磷腊、7g吐温80.4. 2 分离培养z从培养液的薄菌膜处挑取培养物，却j线接种在十六烧三甲基澳化镀琼脂平板上，置37培养1824h。凡绿版杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表团湿润，菌落呈灰臼色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏十六烧三甲基澳化镀琼脂时也可用乙酸胶培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37培养24h，绿旅杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，
7、边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长。4,3 染色镜检s挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。4,4 氧化酶试验s取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿隙杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胶试液，在1530s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性4, 5 绿服菌素试验s取可疑菌落23个，分别接种在绿版菌素测定用培养基上，置37培养24h，加入氯仿35ml，充分振荡使培养物中的绿腺菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入IN的盐
8、酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿旅菌素存在4, 6 硝酸盐还原产气试验z挑取被栓的纯培养物接种在硝酸盐陈水培养基中，置37C培养24h，观察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐并将亚硝酸盐分解产生氮气。4. 7 明胶液化试验，取绿腋杆菌可疑菌落的纯培养物，穿肃l接种在明胶培养基内，置37培养24h,取出放冰箱1030min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。4.8 42生长试验挑取纯培养物，接种在普通琼腊斜面培养基上，放在4142培养箱中，培养2448h，绿腋杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长5 检验结果报告被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿版菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿腋杆菌。如绿服菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42c：生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检祥品中有绿腋杆菌。附加说明：本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。本标准主要起草人周淑玉。本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。145
