1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准G/T 5009.30-2003 代替GB/T5009.30-1996 食品中叔丁基握基茵香酶(BHA)与2，6-二叔丁基对甲酣(BHT)的测定2003-08-11发布Determination of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene in foods 2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员再GB/T 5009.30-2003 前言本标准代替GB/T5009.30-1996(食品中叔丁基经基茵香隧(BHA)与2.6-二叔丁基对甲盼(BH
2、T)的测定方法机242 本标准与GBjT5009.30-1996相比主要修改如下2修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中叔丁基资基菌香隧(BHA)与2.6二叔丁基对甲盼(BHT)的测定以按照GBjT20001. 4-2001(标准编写规则第4部分s化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第一法由江苏省卫生防疫站负责起草。本标准第二法由卫生部食品卫生监督检验所、武汉市卫生防疫站、部郭市卫生防疫站负责起草。本标准第二法由上海市卫生防疫站负责起草。本标准于1985年首次发布.1996年第一次修订，本次为第二次修订。1 范围食晶申叔丁基握基菌香酷(BH
3、A)与2，6-二叔丁基对甲酣(BHT)的测定本标准规定了糕点和植物油等食品中BHA、BHT的测定方法。本标准适用于糕点和植物油等食品中BHA、BHT的测定。GB/T 5009.30-2003 本方法检出限:气相色谱法检出量为2.0月，油脂取样量为0.50日时检出浓度为4.0mg/kgo比色法检出量为10.0月，油脂取样量为0.25g时检出浓度为4.0mg/kgo气相色谱法最佳线性范围20.0g100. 0go 第-法气相色谱法2 原理试样中的叔丁基瓷基菌香隧(BHA)和2.6二叔丁基对甲酣(BHT)用石油隧提取，通过层析柱使BHA与BHT净化，浓缩后，经气相色谱分离后用氢火焰离子化检测器检测，
4、根据试样峰高与标准峰高比较定量。3 试剂3.1 石油酷z沸程300C60OC。3.2 二氯甲烧，分析纯。3.3 二硫化碳，分析纯。3.4 无水硫酸锅，分析纯。3.5 硅胶G，60目80日于1200C活化4h放干燥器备用。3.6 弗罗里砂土(Florisil)，60目80目于1200C活化4h放干燥器中备用。3.7 BHA、BHT混合标准储备液z准确称取BHA、BHT纯度为99.0%)各0.1g混合后用二硫化碳溶解，定容至100mL容量瓶中，此溶液分别为每毫升含1.0mgBHA、BHT.置冰箱保存。3.8 BHA、BHT混合标准使用液z吸取标准储备液4.0mL于100mL容量瓶中，用二硫化碳定容
5、至100 mL容量瓶中，此溶液分别为每毫升含0.040mgBHA、BHT.置冰箱中保存。4 仪器4.1 气相色谱仪z附FID检测器。4.2 蒸发器容积200mLo 4.3 振荡器。4.4 层析柱，1cmX30 cm玻璃柱，带活塞。4.5 气相色谱柱2柱长1.5 m，内径3mm的玻璃柱内装涂质量分数为10%的QF-lGas Chrom Q (80目100目。5 试样处理5.1 试样的制备称取500g含油脂较多的试样，含油脂少的试样取1000 g.然后用对角线取四分之二或六分之二，或根据试样情况取有代表性试样，在玻璃乳钵中研碎，混合均匀后放置广口瓶内保存于冰箱中。243 GB/T 5009.30-
6、2003 5.2 脂肪的提取5.2.1 含油脂高的试样(如桃酥等)，称取50g.混合均匀，置于250mL具塞锥形瓶中，加50mL石油隧(沸程为30C60C).放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，残留脂肪备用。5.2.2 含油脂中等的试样(如蛋糕、江米条等)，称取100g左右，混合均匀，置于500mL具塞锥形瓶中，加100mL200 mL石油酶(沸程为30C60C).放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，残留脂肪备用。5.2.3 含油脂少的试样(如面包、饼干等)，称取250g300 g.混合均匀后，于500mL具塞锥形瓶中，加入适量石油酷浸泡试样，放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶
7、剂残留脂肪备用。6 分析步骤6.1 试样的制备6. 1. 1 层析柱的制备于层析柱底部加入少量玻璃棉，少量元水硫酸俐，将硅胶弗罗里砂土(6+4)共10 g.用石油酷湿法混合装柱，柱顶部再加入少量无水硫酸销。6. 1. 2 试样制备3称取5.2制备的脂肪O.50 g1. 00 g.用25mL石油隧溶解移入6.1.1的层析柱上，再以100mL二氯甲烧分五次淋洗，合并淋洗液，减压浓缩近干时，用二硫化碳定容至2.0mL.该溶液为待测溶液。6. 1. 3 植物油试样的制备2称取混合均匀试样2.00g.放入50mL烧杯中，加30mL石油隧溶解，转移到6.1.1层析柱上，再用10mL石油隧分数次洗涤烧杯中，
8、并转移到层析柱，用100mL二氯甲烧分五次淋洗，合并淋洗液，减压浓缩近干，用二硫化碳定容至2.0mL.该溶液为待测溶液。6.2 测定注入气相色谱3.0L标准使用液，绘制色谱图，分别量取各组分峰高或面积，进3.0L试样待测溶液(应视试样含量而定).绘制色谱图，分别量取峰高或面积，与标准峰高或面积比较计算含量。6.3 结果计算244 待测溶液BHA(或BHTl的质量按式(1)进行计算。品VI二7-x:0 xV h, - V, ,.,-. 式中=mj 待测溶液BHA(或BHT)的质量，单位为毫克(mg); hi一一注入色谱试样中BHA(或BHT)的峰高或面积3h, 标准使用液中BHA(或BHTl的峰
9、高或面积$Vi 注入色谱试样溶液的体积;单位为毫升(mL)，Vm一一待测试样定容的体积，单位为毫升(mL);V , 注入色谱中标准使用液的体积，单位为毫升(mL);c、一一一标准使用液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)，食品中以脂肪计BHA(或BHT)的含量按式(2)进行计算。X, = m , X 1000 1 瓦灭I而百式中:X, 食品中以脂肪计BHA(或BHT)的含量，单位为克每千克(g/kg); m一待测溶液中BHA(或BHT)的质量，单位为毫克(mg);m , 油脂(或食品中脂肪)的质量，单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。. ( 1 ) ( 2 ) GB/T 5009.30
10、-2003 7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8 其他8.1 BHA、BHT气相色谱图见图1，BHT BHA 图18.2 气相色谱参考条件:色谱柱长1.5 m，内径3mm玻璃柱，质量分数为10%QF-1的GasChrom Q(80目-100目)。检测器，FID，温度z检测室200(;，进样口200(;，柱混140(;, 载气流量z氮气70mL/min;氢气50mL/min;空气500mL/min, 第二法薄层色谱法9 原理用甲醇提取油脂或食品中的抗氧化剂，用薄层色谱定性，根据其在薄层板上显色后的最低检出量与标准品最低检出量比较而概略定量，对高脂
11、肪食品中的BHT、BHA、PG能定性检出。10 试剂10.1 甲醇。10.2 石油隧(30C-60Cl。245 GB/切09.30-200310.3 异辛烧。10.4 丙酬。10.5 冰乙酸。10.6 正己烧。10.7 二氧六环。10.8 硅胶G:薄层用。10.9 聚酷胶粉200目。10.10 可溶性淀粉。10.11 BHT、BHA、PG混合标准溶液的配制=分别准确称取BHT、BHA、PG(纯度为99.9%以上)各10 mg，分别用丙酣溶解，转人三个10mL容量瓶中，用丙嗣稀释至刻度。每毫升含1.0 mgBHT、BHA、PG，吸取BHT(1. 0 mg/mLl1. 0 mL, BHA(l. 0
12、 mg/mL)、PGO.0 mg/mLl各0.3mL置同一5 mL容量瓶中，用丙酣稀释至刻度。此溶液每毫升含0.20mgBHT、0.060mgBHA、0.060mgPG 10.12 显色剂:2，6-二氯酶-氯亚胶的乙醇溶液(2g/L)。11 仪器11. 1 减压蒸馆装置。11. 2 具刻度尾管的浓缩瓶。11. 3 层析槽:a) 24 cmX6 cmX4 cm, b) 20cmX13cmX8cm 11. 4 玻璃板:5cmX20 cm、10cmX20 cm。11. 5 微量注射器:10.0L12 分析步骤12.1 提取12. 1. 1 植物油(花生油、豆油、菜籽油、芝麻油):称取5.00g油置1
13、0mL具塞离心管中，加入5.0mL 甲醇，密塞振摇5mn，放置2min，离心(3000 r/min3 500 r/min)5 min，吸取上层清液置25mL容量瓶中，如此重复提取共五次，合并每次甲醇提取液，用甲醇稀释至刻度。吸取5.0mL甲醇提取液置一浓缩瓶中，于40C水浴上减压浓缩至0.5mL，留作薄层色谱用。12. 1. 2 猪油称取5.00g猪油置50mL具磨口的锥形瓶中，加人25.0mL甲醇，装上冷凝管于75C水浴上放置5min，待猪油完全溶化后将锥形瓶连同冷凝管一起自水浴中取出，振摇30s，再放入水浴30 s，如此振摇二次后放人75C水浴，使甲醇层与油层分清后，将锥形瓶连同冷凝管一起
14、置冰水浴中冷却，猪油凝固，甲醇提取液通过滤纸滤入50mL容量瓶中，再自冷凝管顶端加入25mL甲醇，重复振摇提取一次，合并二次甲醇提取液，将该容量瓶置暗处放置，待升至室温后，用甲醇稀释至刻度。吸取10mL甲醇提取液置一浓缩瓶中，于40C水浴上减压浓缩至0.5mL.留作薄层色谱用。12. 1. 3 食品(汹炸花生米、酥糖、巧克力、饼干):按5.2测定脂肪的含量，并称取约2.00g的脂肪，视提取出的泊脂是植物油还是动物性脂肪而决定提取方法。可按12.1. 1或12.1.2操作。12.2 测定12.2.1 薄层版的制备12.2.1.1 硅胶G薄层板z称取4g硅胶G置玻璃乳钵中，加10mL水。研磨至粘稠
15、状，铺成5cmX 20 cm的薄层板三块，置空气中干燥后于80C烘1h，存放于干燥器中。12.2. 1. 2 聚酌胶板z称取2.40g聚耽胶粉，0.60g可溶性淀粉置于玻璃乳钵中，加约15mL水，研磨至浆状，铺成10cmX20 cm的薄层板三块，置空气中干燥后于80C烘1h，置干燥器中保存。GB/T 5009.30-2003 12.2.2 点样12.2.2.1 用10L微量注射器在5cmX20 cm的硅胶G薄层板上距下端2.5cm处点三点:标准溶液5.0L、试样提取液6.0L30.0L、加标准溶液5.0L。12.2.2.2 另取一块硅胶G薄层板点三点:标准溶液5.0L、试样提取液1.5L3.6
16、L、试样提取液1.5L3. 6L加标准溶液5.0L，12.2.2.3 用10L微量注射器在10cmX20 cm的聚瞰胶薄层板上距下端2.5cm处点z标准溶液5.0L，试样提取液10.0L，试样提取液10.0L加标准溶液5.0L，边点样边用吹风机吹干，点上一滴吹干后再继续滴加。12.2.3 显色12.2.3.1 溶剂系统硅胶G薄层板:正己统二氧六环-乙重重(42十6+纱，异辛烧丙酣乙酸(70+5+12)。聚酸胶板za) 甲醇丙嗣水(30+10十10)，b) 甲醇丙酣-水(30十10十12.5), c) 甲醇丙酣水(30+10+15)。对甲醇丙嗣水系统，芝麻油只能用a)菜籽油用b)，食品用。展开系
17、统中水的比例对花生油、豆油、猪油中PG的分离元影响。将点好样的薄层板置预先经溶剂饱和的展开槽内展开16cm, 12.2.3.2 展开12.2.3.2.1 硅胶G板自层析槽中取出，薄层板置通风橱中挥干至PG标准点显示灰黑色斑点，即可认为溶剂已基本挥干，喷显色剂，置1l0C烘箱中加热10min，比较色斑颜色及深浅，趁热将板置氨蒸气槽中放置30s，观察各色斑颜色变化。12.2.3.2.2 聚瞰胶板自层析槽中取出，薄层板置通风橱中吹于，喷显色剂，再通风挥干，直至PG斑点清晰。12.2.4 评定12.2.4.1 定性根据试样中显示出的BHT、BHA、PG点与标准BHT、BHA、PG点比较R，值和显色后斑
18、点的颜色反应定性。如果样液点显示检出某种抗氧化剂，则试样中抗氧化剂的斑点应与加入内标的抗氧化剂斑点重叠。当点大量样液时由于杂质多，使试样中抗氧化剂点的R，值略低于标准点。这时应在试样点上滴加标准溶液作内标，比较R，值，见表1。表1BHT、BHA、PG在薄层板上的最低检出量也值及斑点颜色硅胶G极结果聚酷胶板结果抗氧化剂最低检出量/最低检出量/R，值色斑颜色R，值色斑颜色g g BHT 0.73 1. 00 桔红+紫红BHA 0.37 0.30 紫红蓝紫0.52 0.30 灰棕PG 0.04 0.30 灰黄棕0.66 0.30 蓝注，PG在硅胶G板上定性及半定量不可靠，有干扰，且R，值太小，应进)
19、步用聚酌胶板展开。12.2.4.2 概略定量及限度试验根据薄层板上样液点抗氧化剂所显示的色斑深浅与标准抗氧化剂色斑比较而估计含量，如果在12.2.2.1的硅胶G薄层板上，试样中各抗氧化剂所显色斑浅于标准抗氧化剂色斑，则试样中各抗氧化247 GB/T 5009.30-2003 剂含量在本方法的定性检出限量以下(BHA、PG点样量为6.0L.BHT点样量为30.0L)。如果在12. 2. 2. 2的硅胶G薄层板上，试样中各抗氧化剂所显色斑的颜色浅于标准抗氧化剂色斑，则试样中各抗氧化剂的含量没有超过使用卫生标准(BHA、PG点样量为1.5L.BHT点样量为3.6L)。如果试样点色斑颜色较标准点深，可
20、稀释后重新点样，估计含量。12.3 结果计算12.3.1 试样中抗氧化剂(以脂肪计)的含量按式(3)进行计算。x l. X D X 1 000 - ( 3 ) m2X仨X1 000 X 1 000 式中zX 试样中抗氧化剂BHA、BHT、PG(以脂肪计)的含量，单位为克每千克(g/kg), m 薄层板上测得试样点抗氧化剂的质量，单位为微克(g)，V, 供薄层层析用点样液定容后的体积，单位为毫升(mL)，只一一滴加样液的体积，单位为毫升(mL)，D 样液的稀释倍数;m2-容后的薄层层析用样液相当于试样的脂肪质量，单位为克(g)。12.3.2 所示试样中各抗氧化剂定性检出限度，见表20襄2所示试样
21、申备抗氧化剂定性栓出限度BHT BHA PG 试样撞出浓度/(mg/kgl油炸花生米25 10 10 酥糖10 10 10 饼干10 10 10 巧克力25 25 25 油脂25 25 25 第三法比色法13 原理试样通过水蒸气蒸馆，使BHT分离，用甲醇吸收，遇邻联二菌香胶与亚硝酸销溶液生成橙红色，用三氯甲烧提取，与标准比较定量.14 试剂14.1 元水氯化钙。14.2 甲醇。14.3 三氯甲烧。14.4 甲醇(50%)。14.5 亚硝酸锅溶液(3g/L);避光保存。14.6 邻联二商香胶溶液z称取125mg邻联二茵香胶于50mL棕色容量瓶中，加25mL甲醇，振摇使全部溶解，加50mg活性炭，
22、振摇5min过滤，取20.0mL滤液，置于另一50mL棕色容量瓶中，加盐酸0+11)至刻度。l脂用时现配并避光保存。14.7 BHT标准溶液=准确称取0.0500 g BHT.用少量甲醇溶解，移入100mL棕色容量瓶中，并稀释248 GBjT 5009.30-2003 至刻度，避光保存。此溶液每毫升相当于0.50mg BHT o 14.8 BHT标准使用液.临用时吸取1.0mL BHT标准溶液，置于50mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，避光保存。此溶液每毫升相当于10.0gBHTo15 仪器15.1 水蒸气蒸馆装置。15.2 甘油浴。15.3 分光光度计。16 分析步骤16.1 试样处理称
23、取2g5 g试样(约含0.40mg BHT)于100mL蒸馆瓶中，加16.0g元水氯化钙粉末及10.0 mL水，当甘油浴温度达到165(:恒温时，将蒸锢瓶浸入甘油浴中，连接好水蒸气发生装置及冷凝管，冷凝管下端浸入盛有50mL甲醇的200mL容量瓶中，进行蒸馆，蒸馆速度每分钟1.5 mL2 mL, 在50min-60 min内收集约100mL馆出液(连同原盛有的甲醇共约150mL.蒸气压不可太高，以免油滴带出)，以温热的甲醇分次洗涤冷凝管，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。16.2 测定准确吸取25.0mL上述处理后的试样溶液，移入用黑纸(布)包扎的100mL分液漏斗中，另准确吸取0、1.0、2.0
24、、3.0，4.0、5.0mL BHT标准使用液(相当于0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0gBHT), 分别置于黑纸(布)包扎的60mL分液漏斗，加入甲醇(50%)至25mL，分别加人5mL邻联工菌香胶溶液，混匀，再各加2mL亚硝酸纳溶液(3g/L) ，振摇1min，放置10min，再各加10mL三氯甲饶，剧烈振摇1min，静置3min后，将三氯甲烧层分人黑纸(布)包扎的10mL比色管中，管中预先放入2mL甲醇，混匀。用1cm比色杯，以三氯甲烧调节零点，于波长520nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。17 结果计算试样中BHT的含量按式(4)进行计算。m2 X 1 000 x=-_: ( 4 ) m) X X 1 000 X 1 000 式中:X一一试样中BHT的含量，单位为克每千克(g/kgl;m2一一测定用样液中BHT的质量，单位为微克(g); m)一一试样质量，单位为克(g); V，一一蒸馆后样液总体积，单位为毫升(mL);V, 测定用吸取样液的体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。18 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。249
