1、 ICS 65.020.20 CCS B 05 13 河北省地方标准 DB 13/T 61952025 小麦一年多代、分子标记辅助育种 技术规程 2025-12-16 发布2026-01-16 实施河北省市场监督管理局发 布 DB 13/T 61952025 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所、河北省种子总站等。本文件主要起草人：董福双、刘志芳、焦博、杨阳、郑文永
2、孙雷、马晓丽、周硕、王娇、马春红、赵璞、朱彦辉。DB 13/T 61952025 1 小麦一年多代、分子标记辅助育种 技术规程 1 范围 本文件规定了小麦一年多代、分子标记辅助育种技术的前期准备、育种方案、幼胚培养、分子标记辅助育种、分子标记田间辅助选育等技术要求。本文件适用于小麦一年多代、分子标记辅助育种。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4404.1-2008 粮食作物种子 第1部分：禾谷类 3 术语和定义 本文件
3、没有需要界定的术语和定义。4 符号、代号、缩略语 本文件所涉及的主要符号、代号、缩略语的全称及中文释义如下：ddH2O double distilled water 双蒸水 MAS Mark-assited selection 分子标记辅助选择 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 DNA Deoxyribo Nucleic Acid 脱氧核糖核酸 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 5 前期准备 仪器 5.1.1 DNA 提取仪器 核酸提取磨样机、水浴锅、移液器（1 ml、100 ul、10 ul）、涡旋仪、低温高速离心
4、机（最高转速10000rpm）和通风橱等。5.1.2 PCR 检测仪器 PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统。小麦种植所需设施 5.2.1 主要设施设备 5.2.1.1 光温可控温室。可控温度 15 35；光通量密度 60mol/m2s100 mol/m2s，采光或光照时间 14 h。5.2.1.2 人工气候箱。可控温度 6 25，光通量密度.60mol/m2s100 mol/m2s。5.2.1.3 栽培盆规格。直径 25 cm、高 21 cm。DB 13/T 61952025 2 5.2.1.4 育种田。土壤类型为壤土，具有良好的肥力，pH 值 6.07.5，排水良好，无盐碱化现象；育种田应与其他
5、小麦田保持 25 m 以上间隔距离。生产资料 育苗基质、穴盘、穴盘托等，复合肥、磷酸二氢钾等常用肥料，百菌清、吡虫啉、菊酯类等抑菌防虫药物。6 育种方案 分子标记的筛选及亲本确定 根据育种目标，利用公共数据库（如：http:/wheat.pw.usda.gov）或文献获得目标基因标记信息及供体亲本，并对这些标记的可靠性进行验证。亲本选择 6.2.1 受体亲本宜选择适合当地自然和栽培条件的品种及品系，系谱及遗传背景明确，综合农艺性状优良，且具有较好的配合力。6.2.2 供体亲本宜选择系谱及遗传背景明确，综合农艺性状良好，含有与受体亲本目标性状互补的质量或主效基因。6.3 育种途径 6.3.1 单
6、个基因转育 室内单交(A/B)再连续回交 34 次(BCn)，然后自交 2 次，BCnF3代以后世代分子标记辅助田间选择。6.3.2 多个基因聚合 6.3.2.1 2 个基因聚合 亲本各含1个目标基因，室内单交(A/B)后自交2次，F3代以后分子标记辅助田间选择。6.3.3 个基因聚合 每个亲本各含1个目标基因，采用复交的方式。1个亲本分别与另外两亲本杂交，杂交F0再杂交(A/B/A/C)，然后自交2次，F3代以后世代分子标记辅助田间选择。7 幼胚培养 幼穗选取 取授粉后15 d左右的小麦幼穗，选取麦穗中部的6个小穗，去除包被的颖壳备用。幼粒消毒 在超净工作台中，用1.5%的次氯酸钠进行表面消
7、毒10 min15 min，再用灭菌ddH2O冲洗34次。幼胚获取 在无菌条件下取出完整的幼胚。胚苗培养 DB 13/T 61952025 3 将剥离的完整胚，盾片向下接种于PM培养基（附录A）中，三角瓶装入30 ml PM培养基，每瓶接种710个幼胚。接种好的幼胚在25 C、16 h/d光照培养箱中培养3 d。再生植株温室生产 将培养3 d的胚苗放入8 C10 C的培养箱中、每天光照16 h，春化30 d（注：春性小麦不需要春化）。温室小麦盆栽管理 7.6.1 供试土壤 取田间中等肥力表层土壤与蛭石按1:1比例混合，施入底肥，混拌均匀备用。田间土壤要求：土壤质地为壤土或轻壤土，有机质含量1.
8、5%2.5%；土壤pH值6.07.5；全氮含量0.1%0.2%；有效磷含量15 mg/kg30 mg/kg；速效钾含量100 mg/kg150 mg/kg。7.6.2 施肥管理 小麦复合肥（N-P2O5-K2O=26-17-8）按每吨土1 kg的量在拌土时施入，并在苗期及孕穗期施每盆各施5 g10 g的氮肥。7.6.3 小麦室内管理 采用栽培盆种植，每盆装供试土壤10 kg，每盆定苗8株，于20 C25 C、16 h/d光照栽培，在小麦苗期及拔节期温度控制在15 C22 C，孕穗期及以后温度20 C30 C，土壤含水量60%80%。8 分子标记辅助育种 调节亲本花期 父本分三批次种植于温室，每
9、批次种植间隔5 d；母本与第二批次父本同时种植。DNA 提取 目标基因转育和聚合过程中，对杂交后代通过春化的幼苗按单株编号，移栽前取部分叶片，采用常规的SDS方法或商业试剂盒提取DNA。分子标记检测 依据公共数据库（如：http:/wheat.pw.usda.gov）或文献获得的目标标记信息，设计引物及确定反应条件，记录检测数据。目标基因纯合个体选择 根据检测数据进行分析，保留含有目标基因的幼苗进入下一轮杂交或回交，直到聚合到全部的目标基因，自交2代获得目标基因纯合的单株。9 分子标记田间辅助选育 单株选择 F3/BCnF3F4/BCnF4点播，选择株高、生育期、成穗数、结实性等农艺性好的优良
10、植株，按单株收获，再通过比较种子大小、饱满度等进一步选优劣汰。株行标记确认 F5/BC3F5代种植成株行，每单株种3行，冬前按行内混合取样，提取DNA进行目标基因检测。田间调查时及在收获前后根据一年多代目标选优劣汰。比较试验及技术成果应用 DB 13/T 61952025 4 筛选出综合农艺性状优良的品系，进行两个年度比较试验，择优申请参加国家或省级小麦审定试验；聚合多个优异基因、目标性状优异的品系也可作为创新种质进行保存、共享利用。DB 13/T 61952025 5 A A 附录A （资料性）PM 培养基制作 A.1 实验室常用仪器、器具 培养箱、高温高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4
11、20,-80)、pH测量仪、镊子、组培瓶、酒精灯，以及PM培养基、蒸馏水、琼脂粉等。A.2 PM 培养基配方 表 A.1 PM 培养基配方 名称 分子量 用量 大量元素 氯化钙 KNO3 2300mg/L 氯化钾 NH4NO3 390mg/L 磷酸二氢钾 KH2PO4 300mg/L 七水硫酸镁 MgSO47H2O 250mg/L 二水氯化钙 CaCL22H2O 100mg/L 微量元素 碘化钾 KI 0.83mg/L 硼酸 H3BO3 6.2mg/L 一水硫酸锰 MnSO4H2O 16.9mg/L 契税硫酸锌 ZnSO47H2O 8.6mg/L 二水钼酸钠 NaMoO42H2O 0.25
12、mg/L 五水硫酸铜 CuSO45H2O 0.025mg/L 六水氯化钴 COCL26H2O 0.025mg/L 有机 甘氨酸 C2H5NO2 1mg/L VB1 C12H17ClN4OS 0.5mg/L VB6 C8H11NO3HCl 0.25 mg/L 烟酸 C6H5NO2 0.25 mg/L 铁盐溶液 七水硫酸亚铁 FeSO47H2O 27.8 mg/L 乙二铵四乙酸二钠 Na2-EDTA 37.3 mg/L DB 13/T 61952025 6 表 A.1 PM 培养基配方(续)名称 分子量 用量 激素 NAA C12H10O2 0.02 mg/L BA CHClNO 0.05-0.1
13、mg/L 附加 蔗糖 C12H22O11 30g/L 活性炭 3g/L 琼脂 4.5g/L 注：PH=5.8 A.3 制作步骤 A.3.1 配制溶液 向容器内加入所需蒸馏水的一部分，按照配方称取各种药品，并依次加入（前面的药品充分溶解后再添加后面的药品），最后补足所需水分。对难溶的物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。A.3.2 琼脂的溶解 将配制溶液煮沸，均匀撒入琼脂粉，最后加入活性炭，琼脂和活性炭需要边加热边搅拌。A.3.3 调PH 用1N的HCL和1N的NaOH把培养基调节到PH5.8。A.3.4 分装 将搅拌均匀的培养基，倒入提前备好的100 ml三角瓶中，每个三角瓶分装30 ml左右，用封口膜封口，采用高压蒸气灭菌121灭菌15 min20 min。
