1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 6540 伊 犁 哈 萨 克 自 治 州 地 方 标 准 DB 6540/T 0222023 马红球菌 PCR 检测方法 PCR test method for streptococcus equi 2023-10-30 发布2023-11-30 实施伊犁哈萨克自治州市场监督管理局发 布 DB 6540/T 0222023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由昭苏县西域马业有限责任公司提出。本文件由伊犁州畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位：昭苏县西域马业有限责任
2、公司、新疆农业大学、昭苏县畜牧兽医发展中心、中国农业大学、伊犁哈萨克自治州昭苏马场、新疆维吾尔自治区地方国营伊犁种马场、乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、新疆农业职业技术学院、尼勒克县胡吉尔台乡畜牧业发展中心。本文件主要起草人：马玉辉、吕燕、李海、赵红琼、刘璐、余万里、余海、叶斯哈提胡安、芦文圆、付强、马思远、刘来珍、苏艳、郝智慧、邓海峰、郑文祥、夏利宁、马雪连、王金泉、姚刚、蔡扩军、蔡鹏、蔡涛、顾伟芳、雷艳、倪艳、江阿拜居玛德勒汗。DB 6540/T 0222023 1 马红球菌 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了马红球菌的PCR检测方法。本文件适用于马匹上呼吸道渗出物（鼻拭子）及粪便
3、（肛拭子）样本中马红球菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。马红球菌 rhodococcus equi,R.equi R.equi属放线菌目、诺卡菌科、红球菌属。该菌是一种革兰阳性兼性胞内寄生球杆菌，耐酸，无孢子，大多无鞭毛。R.
4、equi可以在肺泡巨噬细胞中存活并复制，导致不同动物物种和人发生肺部和肺外化脓肉芽肿感染。聚合酶链式反应 polymerase chain reaction,PCR 体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板先经高温变性为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以4种dNTPs为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。R.equi：马红球菌(Rhodococcus equi)ChoE：胆固醇氧化
5、酶(Cholesterol oxidase)VapA：毒力相关脂蛋白(Virulence-Associated Protein A)DNA：脱氧核糖核酸(Desoxyribonucleic acid)PCR：聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(Deoxynucleotide triphosphate)ddH2O：双蒸水(Double distilled water)DB 6540/T 0222023 2 Taq：水生栖热菌(Thermus aquaticu)5 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，所有培养物和废弃物应小心处置。并按
6、照GB 19489中的有关规定进行。6 诊断方法 主要设备、试剂及耗材 冰箱、速冷冻离心机、恒温水浴锅、混匀器、高压灭菌器、电子天平、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（10 L，100 L，1000 L）、一次性吸头（10 L，100 L，1000 L）、PCR管、一次性使用采样器（拭子）、50%（体积比）甘油、胰酪大豆胨琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、细菌基因组DNA提取试剂盒、TE缓冲液、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、DNA ladder、PCR扩增相关试剂（详见附录A）。样本采集、保存 6.2.1 样本采集器具 采样器具为一次性无菌产品，一套清洁采样工具仅限一个样本使用。存放样
7、本的容器应清洗干净，121 20 min灭菌后使用，或为一次性使用无菌容器。6.2.2 样本采集步骤 采样人员将马匹保定，将一次性使用采样器轻轻插入马匹咽腔、鼻腔或肛门（鼻腔深度约为8 cm10 cm，肛门深度约为3 cm5 cm），轻轻旋转棉拭子不少于3圈，抽出棉拭子，将拭子样品端置于含有1 mL甘油肉汤的无菌2 mL离心管中，室温条件下24 h内运送至实验室，2 8 条件下3 d内运送至实验室。如样本不能及时送达实验室，应置于-20 以下长时间保存。6.2.3 核酸提取 样本运送至实验室后，将采集的样本涡旋混匀，在超净工作中划线接种于NMNAT鉴别培养基上，30 培养48 h，观察菌生长情
8、况。挑取生长成灰黑色粘稠样的单菌落，使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌基因组DNA，置于-20 待检。检测方法 6.3.1 引物序列 表1 引物列表 基因名称 引物序列 片段大小 bp VapA F 5-GACTCTTCACAAGACGGT-3 569 R 5-TAGGCGTTGTGCCAGCTA-3 ChoE F 5-GTCAACAACATCGACCAGGCG-3 957 R 5-CGAGCCGTCCACGACGTACAG-3 DB 6540/T 0222023 3 6.3.2 PCR 扩增体系 6.3.2.1 PCR 反应体系（25 L）：2Taq Master Mix，12.5 L
9、；ddH2O，8.5 L；上游引物，1 L（0.5 M）；下游引物，1 L（0.5 M）；模板，2 L。6.3.2.2 PCR 反应程序：94 预变性 5 min；94 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 30 s，30个循环；72 延伸 10 min，4 保存。PCR 反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整.6.3.2.3 质控：检验过程设计阳性对照（ATCC 33701 致病性 R.equi 标准菌株）、阴性对照（ATCC 6939非致病性 R.equi 标准菌株）。6.3.3 PCR 产物电泳检测 用1TAE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖（含100 l/L荧光染料）
10、，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚好没过胶面，将5 L PCR产物加入样品孔内，电泳时以DL Marker 2000作为参照，5 V/cm电泳约30 min；凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。结果判定 致病性R.equi PCR产物为957 bp及569 bp两条条带。6.4.1 PCR 检测试验成立判定 DNA marker分子质量标准电泳道出现其说明书中显示的各分子量清晰条带；阳性对照电泳道出现约957 bp和569 bp大小的两条目标扩增条带；阴性对照电泳道仅出现约957 bp大小的一条目标扩增条带，参见附录B中图B.2，则试验成立。否则，试验不成立。6.4.2 PCR 检测结
11、果判定 在6.4.1成立的基础上，判定检测结果：被检样品泳道扩增到约957 bp和569 bp大小的两条目的条带，则判定为致病性R.equi核酸阳性，见附录B中图B.2泳道1；被检样品泳道仅扩增到约957 bp大小的一条目的条带，则判定为非致病性R.equi核酸检测阳性，见附录B中图B.2泳道2；如果两个目的条带均未出现，则判定为R.equi核酸检测阴性。6.4.3 确证试验 将提取的细菌基因组DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司及杭州有康生物科技有限公司委托完成基因组16S rRNA的一代测序，将序列进行拼接比对，比对结果为R.equi，则表明PCR检测结果为阳性，该样本中存在R.eq
12、ui。废弃物处理和防止污染的措施 检验过程中的废弃物，收集后统一高压灭菌处理。DB 6540/T 0222023 4 A A 附录A （规范性）PCR 诊断用主要试剂溶液配方 A.1 TE 缓冲液（pH=8.0)Tris（1 mol/L pH 8.0）10 mL EDTA（0.5 mol/L pH 8.0）2 mL 加水定容至1 L，121 高压灭菌15 min，4 保存即可。A.2 TAE 电泳液（50）Tris 242.0 g 冰乙酸 57.1 mL EDTA（0.5 mol/L pH 8.0）100.0 mL ddH2O补充至 1.0 L 使用时用去离子水稀释至1的TAE电泳液。A.3
13、0.01 mol/L PBS 溶液（pH 7.2 pH 7.4）NaCl 8.0 g KCL 0.2 g KH2PO4 0.24 g Na2HPO412H20 3.65 g 使用800 mL去离子水溶解，调节pH至7.2 7.4，加水定容至1 L。121 高压灭菌15 min，室温保存即可。A.4 1%琼脂糖凝胶 称取1.0 g琼脂糖，加入100 mL电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭溶液至终浓度为1 g/mL，15 25 冷却至固态，现配现用。A.5 NMNAT 培养基 称取TSA培养基40 g于1 L双蒸水中，搅拌溶解，高压灭菌20 min，冷却至50 60。加入配制好的新生霉素，终浓度为2
14、5 g/mL；放线菌酮，终浓度为40 g/mL；萘啶酸，终浓度为20 g/mL；亚碲酸钾35 mg（3.5%）。培养基混匀后，倒入直径为100 mm的细菌专用培养皿中，待冷却凝固后放置于4 贮存备用。DB 6540/T 0222023 5 B B 附录B （规范性）马红球菌菌落形态及 PCR 检测电泳图 B.1 马红球菌菌落形态图 NMNAT鉴别培养基30 培养48 h，马红球菌菌落形态见图B.1。图B.1 马红球菌菌落形态 B.2 样本采集、核酸提取步骤 马红球菌PCR检测结果电泳例图见图B.2。说明：MDL2000 Maker；1致病性马红球菌（ChoE+、VapA+）；2非致病性马红球菌
15、（ChoE+、VapA-）。图B.2 马红球菌 PCR 检测电泳图 DB 6540/T 0222023 6 C C 附录C （资料性）马红球菌基因扩增片段 C.1 马红球菌 CHOE 基因扩增片段（957 bp）1 gtcaacaaca tcgaccaggc gtggttcgag tccaccgagt ggtacaagtt cgcccgcacc 61 ggccgcaaga ccgcccaacg ttcgggtttc acaaccgctt tcgtgcccaa cgtgtacgac 121 ttcgagtaca tgaagaagga ggctgccggc caggtcacca agtcgggcc
16、t cggcggtgag 181 gtcatctacg gcaacaacgc cggcaagaag tcgctcgaca agacctacct cgcgcaggcc 241 gcggccaccg ggaagctgac gatcacgact ctgcaccgcg tcaccaaggt cgcgccggcc 301 accggcagcg gctacagcgt gacgatggaa cagatcgacg agcagggcaa cgtcgtcgcc 361 accaaggtcg tcaccgccga tcgggtgttc ttcgcggccg gcagcgtcgg caccagcaag 421 ctc
17、ctggtct cgatgaaggc gcagggccac ctgccgaacc tgtcgtcgca agtcggcgag 481 ggctggggca acaacggcaa catcatggtg ggccgcgcga accacatgtg ggacgccacc 541 ggatccaagc aggccaccat cccgacgatg ggaatcgaca actgggccga cccgacggca 601 ccgatcttcg cggagatcgc cccgctgccg gccgggctcg agacctacgt cagcctgtac 661 ctggccatca cgaagaaccc c
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19、 acgtggtgga cggctcg C.2 马红球菌 VapA 基因扩增片段（569 bp）1 atgaagactc ttcacaagac ggtttctaag gcgatcgcag ccacagccgt agctgcggct 61 gcggctatga ttcccgccgg cgtcgctaat gcgaccgttc ttgattccgg tagcagcagt 121 gcgattctca atagtggggc aggcagtggc attgtcggtt ctgggagcta tgacagctcg 181 acgacttcgt taaaccttca gaaagacgaa ccgaacgg
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