1、ICS 65.020.20CCS B 05 4415汕尾市地方标准 DB4415/T 242023 甘薯病毒分子检测技术规程 Technical regulations for molecular detection of sweet potato virus 2023-09-14 发布 2023-10-08 实施汕尾市市场监督管理局 发布DB4415/T 242023 I前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则的规定编写。本文件由汕尾市市场监督管理局提出并归口。本文件起草单位:汕尾市农业科学院。本文件主要起草人:柯杰、熊振乾、周国昌、
2、王聪浩、方壮东、彭远璇、范琴、叶建东、叶祥俊、林少钦。DB4415/T 242023 1甘薯病毒分子检测技术规程 1 范围 本文件规定了甘薯病毒分子检测技术规程的术语和定义、检测对象、抽样方法、检测、结果判定以及记录和归档。本文件适用于汕尾市区域内甘薯脱毒组培苗、原原种、原种以及生产用种的病毒分子检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 402 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检
3、测技术规程 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 分子检测 molecular detection 以功能基因、核糖体、ITS等区域为标靶，采用分子生物学的方法在基因水平上对物种进行鉴定。3.2 引物 primer 指一段短的核苷酸序列。其功能是作为核苷酸聚合作用的起点，在聚合反应时，引导合成一条与模板DNA互补的序列。3.3 聚合酶链式反应 PCR;polymerase chain reaction 在DNA聚合酶的作用下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性，退火，延伸等
4、步骤，体外复制出与母链DNA互补的子链DNA的过程，是一项能快速特异性的在体外扩增目的DNA片段的技术。3.4 逆转录聚合酶链式反应 RT-PCR;reverse transcription polymerase chain reaction 以RNA为模板，通过反转录形成互补的DNA序列，再以此DNA为模板进行PCR扩增，是一项能快速特异性的检测目的RNA的技术。DB4415/T 242023 24 检测对象 4.1 DNA 病毒 a）甘薯类花椰菜花叶病毒（SPCV）b)甘薯曲叶病（SPLCV）4.2 RNA 病毒 a)甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）b)甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）c)甘薯
5、 G 病毒（SPVG）d)甘薯潜隐病毒（SPLV）e)甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）f)甘薯脉花叶病毒（SPVMV）g)黄瓜花叶病毒（CMV）5 抽样方法 抽样方法应符合 SN/T 2122 和 SN/T 2964 中的规定，遵循随机的原则，根据样品的特性和样品中可能存在的病毒表现出的症状特点，确定取样方法、取样数量、取样工具、保存方法等。对实验室检测发现疑似病毒，但还不能做出准确判断，需要更多样品进行确认时，需重新制定更为合适的取样计划，进行再次取样。6 检测 6.1 聚合酶链式反应（PCR）检测 用于检测甘薯 DNA 病毒。6.1.1 试剂及缓冲液的配置 试剂及缓冲液用水应符合 GB/T 6
6、682 的规定，配置按 NY/T 402 附录 C.1 执行。6.1.2 样品 DNA 的提取 样品 DNA 的提取按 NY/T 402 附录 C.2 执行。6.1.3 对照组 以 ddH2O 作为检测的阴性对照。6.1.4 引物 a）甘薯类花椰菜花叶病毒（SPCV）:F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC，R-ATTTCTAATTTGGTTTACTAATCC，扩增产物 922 bp；b）甘薯曲叶病（SPLCV）：F-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC，扩增产物 823 bp。6.1.5 PCR 扩增 采用 DNA 病
7、毒特异引物进行 PCR 扩增；反应体系（25 L）：样品总 DNA（约 100 ng/L）2 L，2Taq Master Mix 12.5 L，上、下游引物（10 mol/L）各 1 L，ddH2O 补齐至 25 L；扩增条件：DB4415/T 242023 394 2 min；94 30 s，退火 45 s，68 1 min，30 次循环；68 10 min；4 保存；扩增产物用于后续凝胶电泳检测。6.1.6 PCR 产物的电泳检测 取 10 L PCR 扩增产物与 1 L 10loading Buffer 混合后，1%琼脂糖凝胶恒压（120 V150 V）下电泳 20 min30 min，
8、EB 染色后，凝胶成像仪拍照观察。6.2 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 用于检测甘薯 RNA 病毒。6.2.1 试剂及缓冲液的配置 试剂及缓冲液用水应符合 GB/T 6682 的规定，配置按 NY/T 402 附录 D.1 执行。6.2.2 样品 RNA 的提取 样品 RNA 的提取按 NY/T 402 附录 D.2 执行。6.2.3 对照组 以 ddH2O 作为检测的阴性对照。6.2.4 引物 a）甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）：F-CGGTCARATTGGAAGGT，R-TTCGCTATCAAAGAAGTRTC，扩增产物 304 bp；b）甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）：F-G
9、CATGGTATGARGGAGTYAA，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG，扩增产物 589 bp；c）甘薯 G 病毒（SPVG）：F-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG，R-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA，扩增产物 1191 bp；d）甘薯潜隐病毒（SPLV）：F-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG，扩增产物 1076 bp；e）甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）：F-CTATGCTGCTCACTCAAGC，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG，扩增产物 600 bp；f）甘薯脉花叶病毒（
10、SPVMV）：F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT，扩增产物 1015 bp；g）黄瓜花叶病毒（CMV）:F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG，R-TCARACTGGGAGCACYCCWGAYGT，扩增产物 657 bp；6.2.5 反转录 反转录过程按 NY/T 402 附录 D.3.2 执行。6.2.6 PCR 扩增 采用 RNA 病毒特异引物进行 PCR 扩增；反应体系（25 L）：合成的 cDNA 2 L，2Taq Master Mix 12.5 L，上、下游引物（10 mol/L）各 1 L，
11、ddH2O 补齐至 25 L；扩增条件：94 2 min；94 30 s，退火 45 s，68 1 min，30 次循环；68 10 min；4 保存；扩增产物用于后续凝胶电泳检测。6.2.7 PCR 产物的电泳检测 取 10 L PCR 扩增产物与 1 L 10loading Buffer 混合后，1%琼脂糖凝胶恒压（120 V150 V）下电泳 20 min30 min，EB 染色后，凝胶成像仪拍照观察。DB4415/T 242023 47 结果判定 PCR 产物经电泳检测，阳性对照在预期大小位置出现特异性条带，同时，阴性对照组没有出现预期大小的特异性条带，则判定样品为相应病毒阳性，否则判定样品为该病毒阴性。8 记录和归档 记录包括样品来源、种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存于-80冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。
