1、ICS 65.020.01 B 40 武汉市地方标准 奶牛早期妊娠诊断的荧光定量 PCR 检测方法 2018-08-28 发布2018-09-28 实施武汉市质量技术监督局 发 布 DB4201 DB4201/T 5432018 DB4201/T 543-2018 I 前 言 本规范按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由武汉市农业科学院提出并归口。本标准起草单位：武汉市农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：程蕾、向敏、王定发、胡修忠、刘晓华、余婕、周源、万平民、凌明湖。本规范首次发布。DB4201/T 543-2018 1 奶牛早期妊娠诊断的荧光定量 PCR 检测方法 1
2、 范围 本标准规定了奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测方法原理、试剂和材料、仪器和设备、测定方法、卫生要求以及废弃物处理。本标准适用于一级生物安全水平（BSL-1）以上的兽医实验室，用于奶牛人工授精后第18天是否妊娠的诊断性检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 早期妊娠 奶牛妊娠初期，又称早孕。此阶段正是受精
3、卵向胚胎剧烈分化的重要时期。3.2 荧光定量 PCR 荧光聚合酶链反应。3.3 Ct 值 循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.4 ISG15 干扰素刺激基因 15。DB4201/T 543-2018 2 3.5 RSAD2 病毒抑制蛋白。3.6 RNA 核糖核酸。3.7 cDNA 互补脱氧核糖核酸。3.8 bp 碱基对。3.9 ddH2O 双蒸水。3.10 P 值 诊断点，判断为妊娠的临界值。4 方法原理 利用荧光定量PCR技术联合检测奶牛外周血白细胞中干扰素刺激基因ISG15和RSAD2的表达量，通过方法换算来判断早期妊娠。5 试剂和材料 试剂和材料包括：双蒸
4、水（应符合 GB/T 6682 中一级水规格）；商业化血液总 RNA 提取试剂盒（应适用于新鲜的全血）；商业化反转录试剂盒；荧光定量 PCR 预混液 SYBR Green；引物（见表 1，各引物的终浓度为 10mol/L）DB4201/T 543-2018 3 表1 定量 PCR 引物的序列及参数 目的基因 引物序列(5-3)退火温度()扩增长度(bp)ISG15 F:GGTATCCGAGCTGAAGCAGTTR:ACCTCCCTGCTGTCAAGGT62 87 RSAD2 F:GCTGAAAGAAGCAGGTATGGAR:CGTACTTCTGGAACCACCTCT 58 176-Actin
5、F:CTGGACTTCGAGCAGGAGAT R:GGATGTCGACGTCACACTTC 58-62 208 荧光定量 PCR 反应板、封膜 无 RNA 酶 PCR 管（0.2 mL、0.5 mL 和 1.5 mL）无 RNA 酶枪头（10 uL、200 uL、1000 uL）一次性手套 6 仪器和设备 仪器和设备包括但不限于：荧光定量 PCR 扩增仪；高速台式冷冻离心机；普通台式离心机；涡旋振荡器；微孔板迷你离心机；冰箱：-80，-20，4；微量可调移液器（2.5 uL、10 uL、100 uL、1000 uL）。7 测定方法 7.1 样本的采集、保存和运输 分别于人工授精后0 天和18
6、天，将奶牛尾部两脊间清理干净，从尾静脉采集外周血样本1.5-2 mL，迅速注入抗凝管中，轻轻摇匀后至冰上，2小时内转运至实验室进行RNA提取，期间避免剧烈晃动。7.2 样本 RNA 的提取 用新鲜血液总RNA提取试剂盒完成血液中总RNA提取，之后利用NanoDrop 2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度，OD260/280=1.9-2.1，同时采用改良的常规琼脂糖凝胶（1.2%）电泳检测RNA完整性（参照谢胜松，李新云，苏立杰，等.一种简易快速鉴定动物组织总RNA质量的方法），凝胶上显示出两条清晰的条带，分别为28S和18S，表明总RNA无降解，样本通过质检。将RNA分装并于-80
7、保存备用。7.3 逆转录反应 逆转录采用商业化反转录试剂盒进行，每个反应RNA用量为500 ng，根据RNA的浓度计算得出每次反应所需的体积，按照试剂盒推荐的反应体系和扩增程序进行。7.4 荧光定量 PCR 检测 ISG15 和 RSAD2 基因在奶牛外周血中的相对表达量 DB4201/T 543-2018 4 7.4.1 牛 ISG15、RSAD2 基因和内参基因-Actin 荧光定量 PCR 扩增体系为：2SYBR Green 10 L，上、下游引物各 0.5 L（10 mol/L），cDNA 模板 0.3 L，ddH2O 8.7 L，共 20 L；按以上体系向荧光定量 PCR 96 孔反
8、应板依次加入试剂和模板，每个样本重复 3 次。加样结束后，采用微孔板迷你离心机离心 20-30 S 后放入荧光定量 PCR 扩增仪。7.4.2 7.4.2 荧光定量 PCR 反应条件如下：ISG15 基因：95C 预变性 60s，95C 变性 15s，62C 退火15s；72C 延伸 30s，共 40 个循环；RSAD2 基因反应条件：95C 预变性 60s，95C 变性 15s，58C 退火15s；72C 延伸 30s，共 40 个循环；-Actin 基因反应条件：95C 预变性 60s，95C 变性 15s，62C 或58C 退火 15s；72C 延伸 30s，共 40 个循环。7.5 结
9、果计算与判断 7.5.1 结果计算 a)奶牛早期妊娠诊断依据 P 值计算公式 P=1/1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2).(1)式中：X1：人工授精后18天奶牛外周血中ISG15的表达量相对于0 天时表达量的倍数 X2：人工授精后18天奶牛外周血中RSAD2的表达量相对于0 天时表达量的倍数 b)X 的计算式 Xn=2-Ct，（n=1，2）(2)其中，Ct计算公式 Ct=（待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组组内参基因Ct值）式中：目的基因：ISG15或RSAD2基因 内参基因：-Actin基因 7.5.2 判断标准 敏感性（真阳性率
10、）为94.7%时的诊断点为：P=0.680，P0.680时，即为妊娠，否则为空怀。8 卫生要求和废弃物处理 废弃物的处理应符合GB 19489实验室生物安全通用要求。9 检测工作 DB4201/T 543-2018 5 9.1 在检验工作流程中，全程对样品的流向及检验进度进行监控：检测科负责人负责安排检测任务分流及下达；各检测室组织检测任务的接收、检测，编制并校对检测原始记录；报告审核人负责检测报告的审核；检测科负责检测样品的管理、检测报告的编制、审核、发放、检测报告副本和原始记录归档管理；样品处理保管员按相关程序对剩余样品进行处理。9.2 建立样品的唯一性标识，保证样品在检测和保存期间不发生
11、混淆，所有的交接环节要有相关人员签字。9.3 优先使用国家标准、行业标准、地方标准及农业部规定的检测方法。并定期对技术标准和规范进行收集和查新，对其有效性进行确认。9.4 样品在检测完毕后，需至少保存 6 个月。9.5 建立实验试剂和实验材料购买、保存和使用记录。10 记录与报告 10.1 建立和维持记录控制程序，规定记录的识别、收集、索引、存档、维护、清理及保存期限等。10.2 检测原始记录应有统一、固定的格式，包含足够的信息，数据真实、填写规范、信息完整，保证该检测在尽可能接近原条件的情况下能够复现。10.3 检测原始记录应有检测人员、复核人员二级签字。10.4 利用计算机或自动设备对检测
12、数据、信息资料进行采集、处理、记录、报告或存贮时，应及时备份，有安全保障措施，避免原始信息或数据的泄露、丢失或随意改动。10.5 检测报告需包括标题、检测实验室名称和地址、样品信息、送检日期、检测日期、检测项目、检测依据、检测方法、检测结果等信息，并标注“结果仅与被检样品有关”。10.6 检测报告实施批准人、审核人和编制人三级签字制度。检测结论应加盖检验专用印章，并骑缝加盖检测专用章。10.7 当对已发出的检测报告有实质性修改时，明确规定应收回、更改和重新签发检测报告，明确记载责任人、补救措施和事故处理措施。11 档案管理 11.1 根据有关法律、法规建立档案管理制度，规定归档范围和分类方案，
13、定期立卷、归档。11.2 设立档案室，实行专人集中统一管理，应配置必要的设施，确保档案安全。11.3 建立完整的人员技术档案、仪器设备档案、检测原始记录与报告档案。11.4 技术资料、检测报告及相应的原始记录的保存期限不得少于 5 年；高致病性动物病原微生物相关实验活动的检测报告及记录，保存期限不得少于 20 年。DB4201/T 543-2018 6 A A 附 录 A（资料性附录）兽医实验室管理体系文件 A.1 兽医实验室质量管理手册 应对管理体系的基本要素进行描述，内容包括职责与能力、机构与人员、设施与环境、管理体系、仪器设备、检测工作、记录与报告、档案管理方面。A.2 程序文件 应规定
14、文件控制和维护、管理体系运行和维持、仪器设备、设施和环境、人员培训与考核、样品管理、检测方法选择与确认、检测过程、检测结果质量（含能力验证）、检测记录、结果报告、供应品采购、安全作业、剧毒危险物品管理、内务管理、检测事故处理等方面的控制及管理程序。A.3 管理制度 应包括：实验室管理规定（含卫生、安保要求）、岗位责任制、人员培训与考核制度、仪器设备管理制度、试剂耗材管理制度、样品采集、处理、运输和保存制度、检测记录与报告审核管理制度、档案管理制度、生物安全管理制度、废弃物处理制度、菌（毒）种管理制度、危险品、剧毒品管理制度、年度工作计划、检查和总结制度、保密制度等。A.4 作业指导书 应包括检
15、测操作规程和仪器设备操作规程。A.5 记录表格 应包括外来人员登记表、保护客户机密检测记录表、检测任务通知单、文件（资料）清单、检测结果质量控制有效性评审表、比对和能力验证工作计划表、新检验项目申请表、预防措施记录、质量体系审核计划表、管理评审计划表、工作人员一览表、环境监控记录、仪器设备档案、标准品入库出库登记表、检定计划及实施记录表、检测方法确认申请表、抽样方案、计算机软件登记表、样品接收登记表、检验报告更改申请表、供应商评价表、投诉受理登记表、使用印章登记表、危险品剧毒品使用管理表、合同评审记录表、不符合工作处理记录、消毒记录表、高压灭菌记录、客户信息反馈表、保证公正性检查表、年度质量监督计划表、设备与标准物质期间核查计划表、安全与内务监督检查表等。B _
