1、ICS 65.020.20 B 22 武汉市地方标准 两系杂交水稻品种纯度 SSR 鉴定方法 2017-06-20 发布2017-07-20 实施武汉市质量技术监督局 发 布 DB4201 DB4201/T 5202017 DB4201/T 520-2017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由武汉市农业委员会归口。本标准起草单位：中垦锦绣华农武汉科技有限公司、武汉市农业技术推广中心。本标准主要起草人：徐姮、许树文、昌华敏、熊恒多、李晏斌、刘万里、万元香。本标准首次发布。DB4201/T 520-2017 1 两系杂交水稻品种纯度 SSR 鉴定方法 1 范
2、围 本标准规定了用SSR分析技术进行两系杂交水稻品种纯度鉴定的原理、仪器设备及试剂、相关试剂及溶液配制、推荐引物、操作程序、统计与计算的方法。本标准适用于两系杂交水稻品种纯度的快速鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB 4404.1-2008 粮食作物种子 第1部分：禾谷类 GB/
3、T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 引物 一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，提供3-OH末端作DNA合成的起点，延伸合成模版DNA的互补链。3.2 SSR 标记 简单序列重复标记 由几个核苷酸（一般为2 个6 个）为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列；由于基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增SSR序列即可揭示其多态性。3.3 推荐引物 品种纯度鉴定中优先选用的一套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。3.4 聚合酶链式反应 DB4201
4、/T 520-2017 2 一种利用酶促反应对特定DNA片段进行体外扩增的技术，该技术以短核苷酸序列作为引物，并使用一种耐高温的DNA聚合酶，只需非常少量的DNA样品，在短时间内以样品DNA为模版合成上亿个拷贝。3.5 两系杂交水稻 两系杂交水稻是利用光温敏不育系水稻为基础，与恢复系杂交生产的杂交稻种子。3.6 品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。4 原理 品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列的不同所致，利用不同品种其SSR多态性存在差异的特点达到纯度鉴定目的。简单重复序列（SSR）分布于水稻整个基因组的不同位置上，不同品
5、种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，在凝胶成像系统上观察可辨别SSR电泳谱带。通过选用亲本间具有多态性的SSR引物在杂交种中PCR扩增产物电泳谱带差异，鉴定两系水稻品种纯度。5 仪器设备及试剂 见附录A。6 相关试剂及溶液配制 见附录B。所用试剂均为分析纯。试剂配制用水均应符合GB/T 6682的一级水的要求。7 推荐引物 见附录C，其它在本文件中未推荐的亲本间多态性引物也可以使用。8 操作程序 8.1 样品制备
6、 8.1.1 受检样品的扦样、分样和保存，应符合 GB/T 3543.2 的要求。8.1.2 试样的数量及淘汰值可参考 GB/T 3543.5 要求。检测时将其双亲的标准种子设为对照。8.2 样品 DNA 提取 8.2.1 材料准备 8.2.1.1 亲本 DB4201/T 520-2017 3 每个亲本取20个单株叶片取等量组织混合制取样品，提供的亲本种子应符合GB 4404.1的原种纯度要求。8.2.1.2 杂交种 每个样品取200 粒以上的种子，培养幼苗单株制样应符合GB/T 3543.4要求。8.2.2 DNA 提取 8.2.2.1 亲本 DNA 的提取 按GB/T 3543.4要求的方
7、法培养幼苗取水稻叶片2 cm放入研钵中，加液氮充分研磨至粉末状，然后移入2 ml离心管中，加入500 ul预热（60）的DNA提取液，65 水浴30 min，间隔15分钟颠倒混匀一次，再加入500 ul氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。10 000 rpm离心5 min。将上清液400 ul转入另一支含有800 ul-20 预冷乙醇的离心管沉淀DNA，10 000 rpm离心10 min，弃上清液，再用70乙醇溶液洗涤2 遍，自然条件下干燥后，加入200 ul超纯水溶解DNA，检测浓度，将DNA稀释至20 ng/ul，-20保存留用。8.2.2.2 杂交种 DNA 的提取 按GB/T 354
8、3.4要求的方法培养幼苗取水稻叶片2 cm剪碎移入PCR板单孔内，每个单孔加入BufferA 50 ul，然后将加有样品和BufferA的PCR板放入95 水浴15 min，然后每个单孔加入50 ul BufferB，混匀离心，取2 ul上清作为样品DNA。注：以上为推荐用于水稻纯度鉴定的DNA快速提取方法，样品DNA即取即用，不宜留存；其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。8.3 PCR 扩增 8.3.1 引物选择 首先选择附录C中的引物在亲本中进行扩增，挑选出亲本间检测出差异的引物用于杂交种纯度检测，杂交种纯度检测时加入2个亲本作为对照。8.3.2 反应体系 20
9、ul的反应体系，2 ul样品DNA，1 ul正向引物（10 umol/L），1 ul反向引物（10 umol/L），0.2 ul TaqDNA聚合酶(5 U/ul)，0.2 ul dNTP（10 mM/L），2ul PCR缓冲液(10，pH8.3)，13.6 ul超纯水。8.3.3 反应程序 94 预变性5 min，一次循环：94 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸30 s；运行35 个循环，72 延伸5 min，4 保存。8.4 PCR 产物检测 8.4.1 琼脂糖凝胶制备 将1TAE电泳缓冲液和琼脂糖（2.5浓度）混合煮沸融化，冷却至50 55，加入EB（或EB替代物），使其最终
10、浓度约为0.5 g/ml，适时倒入制胶平台上，待胶凝固后拔出梳子。8.4.2 电泳 DB4201/T 520-2017 4 将制好的凝胶放入加入TAE缓冲液的电泳槽中（缓冲液应高于凝胶表面），清除加样孔气泡和杂质，向加样孔中加入8 ul混有溴酚蓝的PCR产物，接通电源在5 V/CM凝胶的电压下进行电泳，至指示剂（溴酚蓝）接近胶板底部时，结束电泳。8.4.3 拍照记录 将胶板放入凝胶成像系统进行拍照，记录结果并保存。9 统计与计算 如果SSR位点表现双亲带型，则说明品种为真杂种；如果出现单个亲本带型或其他带型，则该种子（幼苗、株）为假杂种。品种纯度（P）的数值以百分数表示，按公式（1）计算：%1
11、00121=NNNP（1）式中：P品种纯度；N1检测种子数；N2非双亲带型的种子数。DB4201/T 520-2017 5 A A 附 录 A（资料性附录）仪器设备及试剂 A.1 仪器设备包括但不限于：PCR 扩增仪；电泳仪；水平电泳槽及配套的制胶附件；凝胶成像系统；高速冷冻离心机；水平摇床；磁力搅拌计；微波炉；高压灭菌锅；紫外分光光度计；移液器：规格分别为 10ul、20ul、100ul、200ul、1 000ul 连续可调；酸度计；恒温水浴锅；电子天平；检验砻谷机。A.2 试剂包括但不限于：吐温 20（W/V）；氢氧化钠；三羟甲基氨基甲烷；氯仿；异戊醇；浓盐酸；冰醋酸；蔗糖；溴酚蓝粉末；乙
12、二胺四乙酸二钠；乙二胺四乙酸；10PCR 反应缓冲液；TaqDNA 聚合酶；琼脂糖；无水乙醇；氯化钠；4 种脱氧核苷酸；石蜡油 A.2.19 甲醛；A.2.20 溴化乙锭（EB）。DB4201/T 520-2017 6 B B 附 录 B（资料性附录）相关试剂及溶液配制 B.1 DNA 提取溶液的配制 B.1.1 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（pH8.0）溶液 称取186.1 g乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA2H2O），加入800 ml水，再加入20g固体氢氧化钠(NaOH)，搅拌，待完全溶解后，冷却至室温，再用NaOH准确调pH至8.0，定容至1 000 ml。在1
13、03.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。B.1.2 0.5 mol/L 盐酸（HCl）溶液 量取25 ml浓盐酸（3638），加水定容至500 ml。B.1.3 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液 称取60.55 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于400 ml水中，用0.5 mol/L盐酸溶液（B.1.2）调pH至8.0，定容至500 ml，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。B.1.4 5mol/L 氯化钠溶液 称取146 g氯化钠（NaCl）溶于水中，定容至500 ml，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 mi
14、n。B.1.5 DNA 提取液 分别称取15 g十二烷基苯磺酸钠（SDS），放入烧杯中，分别加入40 ml乙二胺四乙酸二钠盐溶(pH8.0)(B.1.1)、100ml三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液（B.1.3）和100 ml氯化钠溶液（B.1.4），加水搅拌定容至1 000 ml。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。于-20保存。B.1.6 氯仿-异戊醇（24：1）将氯仿和异戊醇按24：1的体积比例配制混合液。B.1.7 70乙醇溶液 取700 ml无水乙醇，用去离子水定容至1 000 ml。B.1.8 10M NaOH 溶液 取40 g氢氧化钠，
15、加入去离子水定容至100 ml。B.1.9 20吐温 20 溶液 取100 ml吐温20，加入去离子水定容至500 ml。B.1.10 Buffer A DB4201/T 520-2017 7 分别量取5 ml 10M NaOH溶液（B.1.8）和50 ml 20吐温20溶液（B.1.9），加入去离子水搅拌定容至500 ml。临用临配。B.1.11 Buffer B 称取12.114 g三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl），0.744 g乙二胺四乙酸（EDTA），加入去离子水定容至1 L。B.1.12 50 倍 TAE 缓冲液 称取242 g三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl），37.
16、2 g乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA2H2O），加入57.1 ml冰醋酸，加去离子水定容至1 L。B.1.13 溴酚蓝 取1 g溴酚兰溶于30 ml纯净水中，于搅拌台上电搅3 h4 h；取120 ml去离子水于干净旋盖玻璃瓶中，加入240 g蔗糖充分溶解；搅好的溴酚兰溶液倒入蔗糖溶液中混合，定容至400 ml。倒入时，弃沉淀。B.2 PCR 产物检测 B.2.1 琼脂糖凝胶制备 将1TAE电泳缓冲液和琼脂糖（2.5浓度）混合煮沸融化，冷却至50 55，加入EB（或EB替代物），使其最终浓度约为0.5 g/ml，适时倒入制胶平台上，待胶凝固后拔出梳子。B.2.2 电泳 将制好的凝胶放入加入T
17、AE缓冲液的电泳槽中（缓冲液应高于凝胶表面），清除加样孔气泡和杂质，向加样孔中加入8 ul混有溴酚蓝的PCR产物，接通电源在5 V/CM凝胶的电压下进行电泳，至指示剂（溴酚蓝）接近胶板底部时，结束电泳。B.2.3 拍照记录 将胶板放入凝胶成像系统进行拍照，记录结果并保存。DB4201/T 520-2017 8 C C 附 录 C（资料性附录）推荐引物 表C.1给出了推荐引物。表C.1 推荐引物 标记 染色体 臂 正向引物序列（5-3）反向引物序列（5-3）近似片段长度 Marker Chr Arm Forward primer（5-3）Reverse primer（5-3）Appox leng
18、th RM1195 1 S ATGGACCACAAACGACCTTC CGACTCCCTTGTTCTTCTGG 150-160 RM297 1 L TCTTTGGAGGCGAGCTGAG CGAAGGGTACATCTGCTTAG 160-190+RM71 2 S CTAGAGGCGAAAACGAGATG GGGTGGGCGAGGTAATAATG 140-210 RM20 2 L TCTGCAAGCCTTGTCTGATG TAAGTCGATCATTGTGTGGACC 170-180+RM232 3 L CCGGTATCCTTCGATATTGC CCGACTTTTCCTCCTGACG 150-17
19、0 RM85 3 L CCAAAGATGAAACCTGGATTG GCACAAGGTGAGCAGTCC 90+-110 RM5414 4 L ACCATGGTTCAAGAGTGAAA ACAGCTCAACCTGTTGAGTG 100+-120 RM273 4 L GAAGCCGTCGTGAAGTTACC GTTTCCTACCTGATCGCGAC 190+-210-RM267 5 S TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG AGCAACAGCACAACTTGATG 150-170 RM274 5 L CCTCGCTTATGAGAGCTTCG CTTCTCCATCACTCCCATGG 160
20、-170+RM190 6 S CTTTGTCTATCTCAAGACAC TTGCAGATGTTCTTCCTGATG 110-130-RM253 6 S TCCTTCAAGAGTGCAAAACC GCATTGTCATGTCGAAGCC 140+-160 RM336 7 L CTTACAGAGAAACGGCATCG GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG 170-200 RM18 7 L TTCCCTCTCATGAGCTCCAT GAGTGCCTGGCGCTGTAC 160+-170+RM337 8 S GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG CGATAGATAGCTAGATGTGGCC 17
21、0-440 RM72 8 L CCGGCGATAAAACAATGAG GCATCGGTCCTAACTAAGGG 170-200+RM219 9 S CGTCGGATGATGTAAAGCCT CATATCGGCATTCGCCTG 190+-220 RM278 9 L GTAGTGAGCCTAACAATAATC TCAACTCAGCATCTCTGTCC 150-160 RM311 10 L TGGTAGTATAGGTACTAAACAT TCCTATACACATACAAACATAC 170+-190-RM258 10 L TGCTGTATGTAGCTCGCACC TGGCCTTTAAAGCTGTCG
22、C 140+-160 DB4201/T 520-2017 9 表 C.1 推荐引物（续）标记 染色体 臂 正向引物序列（5-3）反向引物序列（5-3）近似片段长度 Marker Chr Arm Forward primer（5-3）Reverse primer（5-3）Appox length RM209 11 L ATATGAGTTGCTGTCGTGCG CAACTTGCATCCTCCCCTCC 130+-150 RM224 11 L ATCGATCGATCTTCACGAGG TGCTATAAAAGGCATTCGGG 130-150 RM19 12 S CAAAAACAGAGCAGATGAC CTCAAGATGGACGCCAAGA 210-250 RM17 12 L TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC GGTGATCCTTTCCCATTTCA 170+-190+
