1、ICS65.020.30CCS B 414106鹤壁市地方标准DB 4106/T 902022种鸡场禽白血病净化技术规范2022-09-26 发布2022-10-16 实施鹤壁市市场监督管理局发 布DB 4106/T 902022I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由鹤壁市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：鹤壁市农业农村发展服务中心、淇县动物防疫检疫中心、淇县农业农村发展服务中心、淇县农业综合行政执法大队、鹤壁市农产品检验检测中心。本文件主要起草人：郭瑞英、王瑞平、张燕芳、路绪玲、张梅山、高娟玉、孙文波、王永鹏、程宝娟
2、、高强、来淑云、周云飞。DB 4106/T 9020221种鸡场禽白血病净化技术规范1范围本文件规定了种鸡场禽白血病净化检测、净化周期与终止、净化状态维持等技术要求。本文件适用于原种鸡群（核心群）各生长阶段的净化检测技术，其他类型鸡群可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 26436禽白血病诊断技术NY/T 680禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。种鸡breeding
3、 chicken经过不断选种、选育，按育种组织制订的文件鉴定承认的鸡品种。根据其经济用途，分为蛋鸡系和肉鸡系。禽白血病avian leukosis,AL由禽白血病病毒(ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的禽类多种肿瘤性疾病的总称。特点是呈渐进性发生和持续性死亡。禽白血病病毒感染鸡群后，导致鸡群生产性能下降，免疫失败，死淘率增加，尤其是产蛋率和蛋的品质下降，鸡苗的品质下降等。ALV 既可通过种蛋垂直感染，也可以水平传播，因此该病一直是种鸡和蛋鸡生产中危害严重的疫病。禽白血病病毒avian leukosis virus,ALV归属于反转录病毒科反转录病毒属。病毒粒子为一直径为80 nm120 n
4、m，平均是90 nm的球状物，其外周是囊膜糖蛋白，其中gp85基因是囊膜蛋白表面的主要成分，主要决定了病毒亚群的特性，内部病毒子核心有一主要的群特异性抗原p27蛋白，其为核衣壳蛋白，主要用于群特异性抗原的检测。动物疫病净化animal disease eradication在特定区域或场所对某种或某些重要动物疫病有计划的通过监测、检验检疫、隔离、扑杀、生物安全等一系列综合措施，最终达到在该范围内动物个体不发病和无感染状态的根除消灭疫病病原的过程，目的是消灭或清除传染源，从而达到并维持动物个体和群体健康。这个特定区域或场所是人为确定的一个固定范围，可以是一个养殖场、一个自然区域、一个行政区，也可
5、以是一个国家。本文件所指净化主要指在种鸡群中（通常为一个种鸡场），通过雏鸡胎粪检测、不同日龄鸡血液病毒分离、公鸡精液中病毒分离等方法，发现并淘汰鸡群中感染禽白血病的鸡只，最终达到鸡群消除该病的过程。DB 4106/T 90202224净化检测程序出壳雏鸡胎粪检测与淘汰4.1.1将种蛋置于出壳纸袋（纸盒）中隔离孵化，每只种鸡所产种蛋单独使用一个出壳纸袋（纸盒），以免出雏时发生横向传播。4.1.2出壳后将雏鸡胎粪挤压于灭菌的 2 mL 离心管中，离心管中预先加入 0.6 mL 样品稀释液（商品化试剂盒中专用稀释液），充分震荡混匀。对每只雏鸡采集完胎粪后，要更换一次性手套或对双手酒精消毒，然后再采集
6、下一只雏鸡的胎粪。4.1.3将雏鸡胎粪样品置入液氮中快速冷冻后取出，放入 25 37 水浴中融化，反复冻融三次，离心，取上清液用于检测胎粪中禽白血病病毒 p27 抗原。4.1.4禽白血病病毒 p27 抗原检测，按照 NY/T 680 的规定或采用等效的商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒进行，也可采用针对禽白血病病毒 p27 抗原的单克隆抗体建立的胶体金试纸条等快速检测方法。4.1.5同一只母鸡所产的雏鸡中，若有一只雏鸡胎粪检测为禽白血病病毒 p27 抗原阳性，则该纸袋（纸盒）中所有雏鸡视为阳性，相应雏鸡及其对应母鸡应全部淘汰。4.1.6阴性鸡作为育种选留进行隔离饲养，来源于同一母鸡的阴
7、性雏鸡放于同一笼中。在育雏期间每个笼具之间应采取阻隔措施以避免水平传播。为避免笼间直接接触和直接气流的对流，可在每个笼具之间用纸板阻隔，在不影响通风的情况下纸板高度应尽量高。开产初期的检测与淘汰4.2.1每只母鸡取开产后的初产蛋 2 枚3 枚采集蛋清，蛋清反复冻融三次，按照 4.1.4 规定的方法逐个检测禽白血病病毒 p27 抗原。也可无菌采集母鸡抗凝血，按照 GB/T 26436 的规定接种 DF-1 细胞进行病毒分离，培养 7 d9 d 后取细胞培养上清，按照 4.1.4 规定的方法检测禽白血病病毒 p27 抗原。4.2.2公鸡分别采集抗凝血和精液同时接种 DF-1 细胞，按照 4.2.1
8、 规定的方法进行禽白血病病毒分离鉴定。精液病毒分离检测可按附录A的规定进行，也可无菌采集血清、精液或肛拭子进行 PCR-HRM 检测。4.2.3检测为阳性的鸡应淘汰，不再作为育种选育个体。对检测为阴性的选留后备种鸡，继续维持小群隔离饲养。留种前的检测与淘汰4.3.1取每只母鸡所产种蛋 2 枚3 枚采集蛋清，按 4.2.1 的规定进行检测。4.3.2公鸡按 4.2.2 的规定进行检测。4.3.3检测为阳性的鸡应淘汰，不再作为育种选育个体。对检测为阴性的选留后备种鸡，继续维持小群隔离饲养。种蛋的选留和孵化按照本文件4.14.3的要求淘汰所有阳性鸡后，每只母鸡仅选用1只检测为阴性公鸡的精液进行人工授
9、精。按育种规定时间留足种蛋，每只母鸡的种蛋均标号。将每只母鸡的种蛋置于写有该母鸡标号的专用孵化纸袋（纸盒）中，防止不同母鸡的种蛋直接接触，置于出雏箱中出雏。不同世代的持续检测经检测合格的种蛋孵出的雏鸡作为净化后第二世代鸡，按照本文件4.14.4的要求实施第二世代的检测和净化。后续世代按此程序继续循环进行，直至评估动物疫病净化示范场评估标准（试行）（2021版）的要求。DB 4106/T 90202235净化周期与终止净化周期确定净化可根据种鸡所处育种时期，对照本文件4.14.4的任何一个时间节点启动净化程序。不同种鸡场可根据其技术条件分别选择本文件4.14.4的任何一时间节点进行检测，但按照本
10、文件4.14.4从出壳开始至留种过程中所有时间节点全部进行检测是实现净化的最短周期。净化效果评估净化效果评估应按照国家农业行业行政主管部门制定的禽白血病净化评估程序和动物疫病净化示范场评估标准（试行）（2021版）的要求进行。达到净化鸡群的检测比例调整对按照本文件5.2的要求进行评估，达到净化要求的原种场可不再按照本文件4.14.4的要求进行普遍性检测，可按照本文件5.2的要求或不低于10%的比例进行抽样监测。检测结果不符合动物疫病净化示范场评估标准（试行）（2021版）的要求，则按照本文件4.14.4的要求重新进入检测净化程序。6已净化鸡群的净化状态维持措施种源的选择对饲养进口祖代及其以下代
11、次的鸡场，应从无外源性禽白血病病毒感染的育种公司购入鸡苗。应要求供应商提供初产种蛋100枚200枚，检测蛋清中p27抗原为阴性。同时，要求供应商提供相关种鸡群在23周龄后的禽白血病病毒血清抗体检测报告和留种孵化前所产种蛋的蛋清p27抗原检测报告。禽白血病净化维持监测种鸡群在饲养过程中应进行禽白血病定期监测，以了解鸡群禽白血病病毒的感染状态。可在种鸡群开产后、留种蛋前，采集500份左右血清样品，用ELISA方法检测禽白血病病毒A/B亚群及J亚群抗体。同时，采集种蛋用ELISA方法检测蛋清中的禽白血病p27抗原。如果血清抗体阳性率或蛋清p27抗原阳性率超过1%时，应对鸡群采集抗凝血接种DF-1细胞
12、进行病毒分离鉴定或采集血清或肛拭子进行PCR-HRM检测。种鸡场生物安全措施6.3.1种鸡场应执行全进全出制度。饲养已经净化的品系时，应避免不同来源的种鸡在同一鸡场饲养而发生交叉感染。一个鸡场在同一时期只能饲养同一批来源的种鸡。不同来源的种蛋在孵化和出雏之时应分开，避免与其他鸡群（特别是非净化鸡群）同时孵化和出壳，以减少禽白血病水平传播风险。6.3.2种鸡场地理位置应相对隔离，远离其他鸡场。运送物品车辆以及人员出入，均应消毒，同时应尽可能降低种鸡场所需物品与外界的交流。接触核心群的工作人员应固定化，避免其他鸡群的饲养员进入实施净化的鸡群中工作。种鸡场应在鸡舍安装防鸟网或其他防鸟设施，并定期检查
13、维护。疫苗的管理和使用净化鸡群使用的针对各种鸡病的弱毒疫苗，应是经过中国兽药典规定程序检测合格的疫苗，确保无外源性禽白血病毒污染。用鸡胚或鸡胚来源的细胞作为原材料生产的疫苗，以及对1日龄雏鸡通过注射法（包括皮肤刺种）使用的疫苗，使用前应进行检测。鸡用弱毒活疫苗中禽白血病病毒污染检测按附录B的规定进行。DB 4106/T 9020224DB 4106/T 9020221AA附录A（资料性）ALV 的分离和分离培养物的检测A.1分离病毒用细胞在分离外源性ALV时，考虑到E亚型的内源ALV的干扰，应选用C/E细胞对内源性ALV-E有抵抗力的细胞，如0系SPF的鸡胚成纤维细胞（CEF）或来自0系鸡胚成
14、纤维细胞（CEF）的传代细胞系DF-1细胞。A.2样品采集和处理A.2.1血浆p27抗原检测阳性率降低到1%以下时，选取400只600只鸡的小群，全群无菌采集抗凝血（用肝素钠做抗凝剂），1500 rpm离心15 min后，取上清液接种于DF-1细胞。A.2.2精液使用75%乙醇将泄殖腔周围擦拭干净，将公鸡精液采集到1.5 mL已灭菌的离心管中，一只公鸡的精液对应一个离心管，编号后放入冰盒中暂存。采集的精液，用含有青链霉素（青霉素100 U/mL，链霉素0.1 mg/mL）的细胞维持液，按照最终稀释度为128156充分混匀后接种DF-1细胞。A.2.3疑似ALV 污染的活疫苗检测马立克氏病细胞结
15、合疫苗从液氮中取出后，在含有疫苗的细胞悬液中加入9倍10倍的灭菌注射用水，将细胞悬液移至小试管混匀，4 放置10 min，让细胞在低渗下裂解死亡后接种于DF-1细胞。A.3病毒接种细胞的方法A.3.1在37 水浴中提前预热消化液（0.25%胰酶）和DMEM（high-glucose）。A.3.2弃去细胞瓶中长满的细胞培养液上清。A.3.3加入PBS清洗两遍后，25 cm2的培养瓶中加入5 ml胰酶。在加入胰酶2 min后消化完全，再加入10 mL的含有10%FBS的DMEM细胞培养液。A.3.41200 rpm离心5 min后弃去上清，加入适量细胞培养液使细胞浓度达到11042104个细胞。A
16、.3.5将细胞悬液加入到24孔板中，每孔0.5 mL，培养24 h36 h，待细胞长满。A.3.6每孔加入分离好的50 L血浆样品以及阴阳性对照。A.3.7在37 细胞培养箱，5%的CO2中培养细胞24 h。A.3.824 h后将细胞培养液更换为含有2%FBS的DMEM的细胞维持液，培养7 d9 d。A.3.97 d9 d后将细胞反复冻融3次，最后一次冻融后，收集每一个样品培养物。DB 4106/T 9020222BB附录B（规范性）PCR-HRM 检测 ALV-JB.1引物序列B.1.1上游引物：CAGGAAACGTGTGGGTCACC。B.1.2下游引物：TTATTGGACTTACCATC
17、G。B.2实验步骤B.2.1从样品中提取病毒RNA。B.2.1.1样品中加入 TRIZOL 后反复吹打几次，使样品充分裂解。室温放置 5 min。B.2.1.2向以上溶液中加入氯仿，每使用 1 mL 的 TRIZOL 加入 0.2 mL 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡 15 s，室温放置 2 min3 min。B.2.1.34 条件下，12000 rpm 离心 15 min，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA 主要在水相中，把 600 L 水相转移到一个新的 RNase-Free 离心管中。B.2.1.4在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置 10 min。B
18、.2.1.54 条件下，12000 rpm 离心 10 min，弃上清。B.2.1.6加入 75%乙醇洗涤沉淀。每使用 1 mL 的 TRIZOL，用 1 ml 的 75%乙醇对沉淀进行洗涤。B.2.1.74 条件下，12000 rpm 离心 3 min，小心吸弃上清，注意不要吸弃 RNA 沉淀。B.2.1.8室温放置 2 min3 min，晾干。加入 30 L50 L无 RNA 的水，充分溶解 RNA 在-70 保存，防止裂解。B.2.2一步法RT-PCR扩增及HRM分析B.2.2.1以试剂盒提取的 RNA/DNA 为模板，Gp85U3/Gp85L3 和 H5/H7b 为引物分别进行一步法 RT-PCR扩增，按试剂盒说明书进行。B.2.2.2将反应液混匀，置于实时荧光定量 PCR 分析仪，RT-PCR 和 HRM 运行程序如下：50 反转录30 min，94 预变性 5 min；94 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 30 min，35 个循环；最终 72 延伸 8 min。B.2.2.3HRM 升温步骤为 75 至 95，升温速率为 0.3/s。HRM 试验结果用 Rotor-GeneQ 2.0.2.软件进行分析。
