1、ICS 65.020.20B 05黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB23DB2308/T 1822023稻瘟病菌无毒基因检测 PCR 法技术规范2023-12-11 发布2024-01-11 实施佳木斯市市场监督管理局发布DB2308/T 1822023I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。本文件
2、主要起草人：陆文静、周通、王桂玲、周雪松、韩笑。本文件 2023 年首次发布。DB2308/T 18220231稻瘟病菌无毒基因检测 PCR 法技术规范1范围本文件规定了稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）无毒基因检测 PCR 法技术规范。包括分子检测原理、仪器设备、试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。本文件适用于黑龙江省佳木斯地区水稻稻瘟病菌无毒基因 AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita、AVR-Piz-t、AVR-Pia、AVR-Co39 的 PCR 检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件
3、。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求3术语和缩略语下列术语和缩略语适用于本标准。3.1正向引物：处于 DNA 双链上游的引物，简称 F 引物。3.2反向引物：处于 DNA 双链下游的引物，简称 R 引物。3.3DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。3.4PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应DB2308/T 182202323.5Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。3.6DNA Marke
4、r：标准分子量的核酸标记。4原理提取稻瘟病菌菌丝 DNA，根据无毒基因保守区域序列设计特异性引物，对样品进行 PCR 扩增，根据序列比对结果，依据是否扩增得到预期的 DNA 片段大小的序列来判断样品是否携带该无毒基因。5仪器设备电子天平、瓷质研钵、研杵、移液枪、水浴锅、高速离心机、核酸浓度测定仪（NanoDrop 2000）、基因扩增仪、琼脂糖电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统，其它相关仪器设备。6试剂及样品干燥的稻瘟病菌丝 0.05 g0.1 g、10%CTAB、5 M NaCl、0.5 M EDTA（pH 8.0）、1 M Tris（pH8.0）、1TE 缓冲液、氯仿：异戊醇（24：1）、75%
5、乙醇、Goldenview 等。除非另有说明，仅使用分析纯试剂和 dd H2O 或符合 GB/T 6682 规定的一级水。7实验过程防污染措施检测过程中防止污染的措施按照 GB/T 19495.2 中的规定执行。8实验步骤8.1稻瘟病菌菌丝 DNA 提取取单孢培养后烘干的菌丝 0.1 g 于研钵中加入液氮用研杵研磨，菌粉转入 2 mL 灭菌离心管，并加入 65 预热的 DNA 提取缓冲液 700 L，盖盖混匀，置于水浴锅内 65 温浴 1 h（期间间隔 15 min摇动混匀，使 DNA 提取缓冲液与菌丝充分混合，保证菌丝 DNA 的提取效率）。12000 r/min 离心 10min，取上清液
6、 600 L 置于新的 2 mL 离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（241）振荡抽提 5 min10 min，12000 r/min 离心 10 min。缓慢吸取上清液 500 L 置于新的 1.5 mL 离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（241）振荡抽提 5 min10 min，12000 r/min 离心 10 min。缓慢吸取上清液 300 L 于新的1.5 mL 离心管，加入 900 L、-20 预冷的无水乙醇，-20 放置 10 min，12000 r/min 离心 10 min。DB2308/T 18220233倒掉上清液，用 75%乙醇洗涤沉淀 3 次，干燥后加入 100 L 1 T
7、E 缓冲液溶解，利用 NanoDrop 2000测定提取 DNA 浓度，并用 1 TE 缓冲液稀释至 100 ng/L，-20 保存备用。8.2PCR 反应8.2.1将 DNA、PrimeSTAR Buffer（5）、dNTP Mixture、正向引物（F）及反向引物（R）及 ddH2O置于冰上融化，引物序列参考附录 A。8.2.2在 0.2mL 加盖无菌离心管中，按先后顺序加入以下试剂：混合后用移液枪抽打混匀，封盖后短暂离心待用。8.2.3将离心管置于 PCR 仪中，反应程序为：95 预变性 5 min，95 变性 30 s，55 61 退火 30 s，72 延伸 30 s60 s（每对引物
8、的退火温度及延伸时间参见附录 A），29 个循环，72 总延伸 5 min，4 保存。8.3电泳用 200 mL 玻璃烧杯称取琼脂糖 0.5 g，加入 0.5 TBE 缓冲液 50 mL。杯口用锡箔纸盖好封严，置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。待琼脂糖温度达到 50 左右时加入 2.5 L Goldenview，混匀，迅速将胶倒至模具中，放上样梳。约 20 min 待胶完全凝固后，拔下上样梳，置于盛有 0.5 TBE 缓冲液的电泳槽中。吸取 5 L PCR 反应液，上样 130 V，电泳 0.5 h1.0 h。电泳结束后，取下琼脂糖凝胶，利用凝胶成像系统观察电泳条带大小，照相。8.4PCR 产物
9、测序使用试剂盒纯化 25 L PCR 产物，提交至生物技术公司测序。PrimeSTAR Buffer（5）6 LdNTP Mixture（2.5 mM）2.4 L正向引物及反向引物（100 nM）0.2 L（终浓度：0.2 M0.3 M）样本 DNA1 L（20-100 ng）dd H2O20.1 LPrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5U/L）0.3 LDB2308/T 182202349结果分析鉴定稻瘟病菌中是否携带某些抗稻瘟病基因时，如不能获得特定长度的 PCR 产物，则可判断试样中不含有相应的无毒基因；如可扩增出特定长度的 PCR 产物，则需结合电泳结果和测序结
10、果共同分析。所有无毒基因的扩增序列应与美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中对应序列相比对。附录A（规 范 性附 录）用于扩增无毒基因的引物引物无毒基因引物序列（5-3）延伸时间（s）退火温度（）Primer1Avr1-Co39FCTCTGAACAACTAAGCAACA4055RCAACCTGGACTCTTATTGATCPrimer2Avr-PiaFTTATTGCTACCACCTTCCTC3055RGTAGTAACTGAGTTGGCGTTPrimer3Avr-PiiF CCTCGGCTTCTTGTATATTACT3055RTAAATCGTGCGCTTTCAGATPrimer4Avr-PikFCTGCACACATCAACAGTCTT3056RTCACAGTTAAGGCAACGTAGPrimer5Avr-Pita1*FGTTTCCGCCTTTATTGGTTT5056RAATCCCATCCCATTCGTAACPrimer6Avr-Pita2*FTTCTCTAACCTGCCACGATA3055RCCTCCATTCCAACACTAACGPrimer7Avr-Piz-tFGATCAAATGAACACCAGGAA3055RCGATGAAGAATGGAAGAATG
