1、ICS 65.020.20B 05黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB23DB2308/T 1842023稻瘟病病菌单孢分离培养技术操作规范2023-12-11 发布2024-01-11 实施佳木斯市市场监督管理局发布DB2308/T 1842023I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。本文件主要起
2、草人：王桂玲、陆文静、韩笑、周雪松、宋成艳。本文件 2023 年首次发布。DB2308/T 18420231稻瘟病病菌单孢分离培养技术操作规范1范围本文件规定了水稻稻瘟病菌分离所使用的仪器和用具、培养基去杂质方法及单孢分离培养程序和方法等技术规范。本文件适用于黑龙江省佳木斯市稻瘟病菌单孢分离技术。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB2308/T 124-2022稻瘟病菌生理小种鉴定技术规程。3术语和定义3.1稻瘟病由稻梨孢真菌引起的一种水稻病害，又称稻热病
3、、火烧瘟、叩头瘟。病菌侵染叶片、茎秆、穗颈、小穗梗和谷粒。根据受害时期和侵染部位不同，可分别引起苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟。3.2单孢分离法由单个孢子繁殖来获得纯菌种的方法。4仪器和用具4.1常用仪器4.1.1超净工作台洁净等级：100 级 0.5 um。平均风速：0.25 m/s0.6 m/s。4.1.2高压灭菌锅温度范围：0135，灭菌时间范围：4 min120 min，最高工作压力：0.22 MPa0.25 MPa。4.1.3恒温培养箱温度范围：050。温度波动：1。光照度：0 LX7500 LX。4.1.4光学显微镜DB2308/T 18420232目镜：10；物镜：10、40。
4、4.1.5电子天平感量 0.01 g。4.2常用用具剪刀、无菌载玻片、试管、接种针、培养皿、医用白瓷盘、滤纸、移液器、医用纱布、酒精灯、记号笔，铗子。5分离技术5.1分离方法悬挂震落法分离单孢菌株。5.2培养基的配制酵母淀粉培养基（淀粉 10 g、酵母粉 2 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水 1000 mL）、琼脂培养基（琼脂粉 15 g20 g、蒸馏水 1000 mL），在 121湿热灭菌 20 min。5.3培养基去杂质琼脂质量的高低对单孢的分离有较大的影响。杂质少，培养基透明度高，孢子震落后在显微镜下易于镜检，可提高挑取单孢效率，如果质量较差，需采用蛋白去杂的方法（每配制 1000 mL 的
5、培养基，可用一颗鸡蛋的蛋清参混。方法是将琼脂粉煮化后，冷却至 40 50，加入蛋清，并迅速用玻璃棒搅动 5 min 左右，使之成泡沫状，再重新加热煮沸，以此琼脂粉中的杂质附着于凝固的蛋白内，而后先用 1 层2 层纱布，将大块蛋白滤除，再用 7 层纱布过滤，所得滤液即可装瓶灭菌备用。）5.4病菌标样消毒取新采集的 1 cm 长的发病组织（节瘟或穗颈瘟）用 75%酒精消毒（30 s 左右），然后用无菌水冲洗。5.5病菌标样培养在干净的培养皿中放入 1 张滤纸或 2 层吸水纸，加入少量无菌水（浸湿吸水纸即可），把冲洗消毒过的发病标样放在吸水纸上盖好后，放在 26 光照培养箱中培养 1 d 2 d，标
6、样表面就会产生深灰色霉层（即孢子）。5.6孢子震落按照 DB2308/T124-2022 执行。5.7单孢镜检镜检时将培养皿反转放在显微镜的载物台上，在 10 10 倍的显微镜下查找稻瘟病菌孢子，同时在其附近无其他孢子和杂菌存在时，用蘸水钢笔在单孢处轻轻点一墨水小圆点，以小圆点为中心画个小圆圈，将点过的小圆点用洒精棉擦掉，再进一步检查所划圆圈内是否是单个孢子，确定无其它孢子后，DB2308/T 18420233再用蘸水钢笔在单孢处轻轻点一墨水小圆点，在无菌条件下将所画圆圈内的单孢挑入酵母淀粉培养基上。5.8单孢提纯将琼脂培养基上的稻瘟病菌单孢接种到酵母淀粉培养基上，在培养皿上注明菌株编号、分离日期后，放入 26培养箱内黑暗培养 3 d5 d，观察菌落生长情况，单孢菌株的菌落形态为圆形。5.9保存将经鉴定得到的稻瘟病菌单孢菌株移至酵母淀粉斜面培养基上，培养 7 d10 d 后备用。
