1、ICS 65.020.20CCS B 05DB1308承德市地方标准DB1308/T 3212023春季萝卜游离小孢子培养技术规程2023-02-25 发布2023-03-01 实施承德市市场监督管理局发 布DB1308/T 3212023I前 言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由承德市农业农村局归口。本文件起草单位:承德市蔬菜技术推广站、围场满族蒙古族自治县蔬菜环保站、兴隆县工商业联合会。本文件主要起草人：王玉宏、郑鹏婧、姜红玉、姜涛、李兵、刘博、王春红、刘斯超、唐丽丽、卞颖。DB1308/T 32120231春季萝卜
2、游离小孢子培养技术规程1范围本文件规定了萝卜游离小孢子培养技术的术语和定义、培养条件、操作流程、操作方法以及档案管理等内容。本文件适用于春季萝卜游离小孢子培养，十字花科蔬菜游离小孢子的培养可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1游离小孢子不形成配子的游离状的单核细胞。3.2游离小孢子培养在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配
3、子，而是像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。4培养条件4.1实验室环境整洁，干净卫生，有温度调节设备，室内温度控制在2027。4.2试剂或材料培养用水符合 GB/T 6682 中规定的三级水，除非另有规定，在培养过程中仅使用分析纯试剂，试剂或材料包括：a)B5 培养基基盐干粉（含维生素）；b)NLN 培养基基盐干粉（不含维生素）；c)肌醇，纯度90.0%；d)蔗糖；DB1308/T 32120232e)琼脂；f)萘乙酸；g)还原型谷胱甘肽，纯度99%；h)L-谷氨酰胺，纯度99%；i)L-丝氨酸，纯度99%；j)一水吗啉乙磺酸，纯度99%；k)乙醇溶液，75%；l)次氯酸钠溶液，5
4、%；m)硝酸钙溶液，25%；n)秋水仙碱溶液，0.3%；o)活性炭悬浮液，1g/100 ml；p)100维生素溶液：甘氨酸 0.1 g、烟酸 0.25 g、维生素 B6 0.025 g、维生素 B1 0.025 g、叶酸 0.025g、D-生物素 0.0025 g，加蒸馏水定容到 500 ml。4.3仪器设备与器具4.3.1仪器设备a)超净工作台；b)立式压力蒸汽灭菌器：压力 0.25 MPa，温度139；c)生化培养箱；d)酸碱度测试仪；e)电子天平：最大称量：220g，实际分度值：0.0001 g；f)离心机：1000 r/min 或以上；g)隔膜真空泵：真空度 200 mbar；h)lo
5、nger-pump蠕动泵：转速 1 r300 r；i)流式细胞仪。4.3.2器具a)烧杯：50 ml；b)三角瓶：100 ml；c)大烧杯：1L；d)研钵：6 cm；e)试管：10 ml；f)古式漏斗：3.5 cm12cm；g)酒精灯：400 ml；h)一次性培养皿：60 mm；i)石蜡封口膜：4 cm125 cm；j)眼科镊子：10 cm；k)手术刀；3号；l)长柄镊子：15 cm。5操作流程DB1308/T 32120233培养基配置超净工作台操作环境培养小孢子植株移栽留种。6操作方法6.1培养基配置6.1.1B5 液体培养基称取 B5 培养基基盐干粉（含维生素）3.164 g，加入 0.
6、1 g 肌醇和 130 g 蔗糖，加蒸馏水定容到 1 L，将培养基 pH 值调至 5.8，分装于 100 ml 三角瓶中，使用蒸汽灭菌器 120湿热灭菌 20 min，灭菌后取出 4保存。6.1.2B5 固体培养基称取 B5 培养基基盐干粉（含维生素）3.164 g，加入肌醇 0.1 g、蔗糖 30 g 和琼脂 7.5 g，加蒸馏水定容到 1 L，将培养基 pH 值调至 5.8，分装于 100 ml 三角瓶中，每瓶 40 ml，使用蒸汽灭菌器 120湿热灭菌 20 min，灭菌后取出，待冷却凝固后 4保存。6.1.3改良 1/2NLN 培养基称取 NLN 培养基基盐干粉（不含维生素）0.387
7、 g，加入硝酸钙溶液 2 ml、100维生素液 10 ml、肌醇 0.1 g、还原型谷胱甘肽 0.03 g、L-谷氨酰胺 0.8 g、L-丝氨酸 0.1 g、蔗糖 130 g 和一水吗啉乙磺酸 0.6396 g，使用大烧杯加蒸馏水定容到 1 L，将培养基 pH 值调到 5.8，使用隔膜真空泵，将培养基经0.2 m 水系微孔过滤膜反复过滤三次，之后在超净工作台中，使用 longer-pump 蠕动泵，将过滤后的培养基再经 0.22 m 过滤器过滤到已经灭菌的三角瓶中，锡泊纸封口，4保存。6.2超净工作台操作6.2.1设备消毒将 50 ml 烧杯、研钵、10 ml 试管、古式漏斗用锡箔纸包扎好，蒸
8、汽灭菌器120灭菌 20 min。将超净工作台内用75%乙醇全面擦拭一遍。将离心机、酒精灯、50 ml 烧杯、10 ml 试管、研钵、古式漏斗、乙醇、次氯酸钠、瓶装无菌水、B5液体培养基、改良1/2NLN培养基、60 mm一次性培养皿、石蜡封口膜等必需品放入超净工作台，紫外线灭菌 30 min。6.2.2准备花蕾待萝卜抽苔后，选取花序上第一朵花开放后的主枝、一级分枝、二级分枝和三级分枝上的萝卜花蕾，经4低温处理 1 d3 d，备用。制备时，选取长度 2.5 mm3 mm 的完整花蕾，去除残次的和长度不符的花蕾。将选取的花蕾放入烧杯中，清水冲洗 30 min，倒出水将花蕾放入超净工作台备用。6.
9、2.3花蕾消毒先将冲洗干净的花蕾用乙醇表面消毒 30 s，期间摇动烧杯，烧杯间不要碰撞。然后使用次氯酸钠深度消毒 15 min，期间多次摇动烧杯，烧杯间不要碰撞，每次摇动结束后，要用乙醇擦拭台面。最后，使用无菌水清洗 5 min，期间摇动烧杯，充分清洗，此步骤重复操作3次，烧杯间不要碰撞，完成清洗后用乙醇擦拭台面。6.2.4研磨花蕾DB1308/T 32120234将消毒过的花蕾放于研钵中，倒入B5液体培养基，液面高出花蕾即可，轻敲研钵，使所有花蕾破裂，花粉释放出即可，加入B5液体培养基定容到 10 ml。6.2.5花蕾液过滤将研磨好的 10 ml 花蕾液倒入古式漏斗，经400目纱网过滤后，移
10、至 10 ml 离心管，使用离心机1000 r/min离心 3 min，倒掉上清液，倒入 1 ml B5液体培养基，将沉淀摇起，定容到10 ml，经3次反复操作后，倒掉上清液，得到纯净的花粉母细胞液。6.2.6分装在纯净的花粉母细胞液中加入 1 ml 改良1/2NLN培养基，将沉淀摇起垂悬，定容到 10 ml，分装到10个 60 mm 的培养皿中，每皿加入 5 ml 改良1/2NLN培养基稀释，并添加活性炭悬浮液 1 ml，最后用石蜡封口膜封口，培养皿表面做好标记。6.2.7超净工作台注意事项超净工作台使用过程中，要求双手不能离开台内，操作中双手要低于物品、水平活动，每一步操作结束后都要用乙醇
11、擦拭台面消毒。6.3环境培养6.3.1现胚培养将分装好的培养皿放入生化培养箱中，33避光热激 24 h，后调至25避光培养23周，即可现胚。6.3.2再生培养在超净工作台环境下，用眼科镊子将子叶型胚接种至B5固体培养基上。接种后在25自然光下培养，三周后子叶型胚发育成幼苗。6.3.3复壮培养在超净工作台环境下，取出幼苗，手术刀去除叶片和根区，长柄镊子将剩余组织接种到新的B5固体培养基中，在25自然光下进行培养，之后继代培养35代，待苗茎粗达到 0.1 cm0.2 cm，萌发出2叶1心，具有一定抗性且生根后，进行炼苗。如根系生长不完善，可在培养基中加入适量萘乙酸，促进根系长成。6.4小孢子植株移栽打开瓶口锻炼 5 d7 d，之后将苗取出洗净根部琼脂，移植于营养杯中，精心管理，在45低温环境下 10 d20 d 通过春化，3周后统计成活率，当苗长到4叶1心时达到成苗标准，即可移栽定植。6.5留种定植后，用流式细胞仪或花粉母细胞染色体计数法检测植株倍性，单倍体植株用秋水仙碱溶液刺激侧芽或根部进行加倍，加倍成功后和双单倍体及多倍体分别进行自交授粉留种。7档案管理DB1308/T 32120235根据小孢子出胚情况、成苗情况以及授粉情况进行统计留档。档案科目包括编号、品种名、类型、出胚总皿数、出胚总数、每皿出胚数、畸形胚数、处理方法、培养日期、出胚时间、成苗数、留种克数。_
