1、ICS DB1304 邯郸市地方标准 DB 1304/T4402023 犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程 2023-08-21 发布 2023-08-30 实施 邯郸市市场监督管理局 发 布 DB1304/T4402023 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则规则起草。本文件由河北工程大学提出。本文件起草单位：河北工程大学、邯郸市标准化所。本文件主要起草人：王方方、钟翠红、刘冠慧、石博文、张永英、王书秀、杨利、李萌、吴丽丽、刘辉、何晓玲、袁英、崔濮凡。DB1304/T4402023 1 犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程 1 范
2、围 本文件规定了双重荧光定量 PCR 检测犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的技术要求。本文件适用于犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的快速检测和流行病学调查，肉牛和奶牛腹泻也可参照执行。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 WS2712007（感染性腹泻诊断标准）3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。3.1 P
3、CR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)3.2 RT-qPCR：荧光定量 PCR(Real-time quantitative PCR)3.3 PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)3.4 Ct 值：循环阈值(Cycle Threshold)3.5 DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)3.6 Tm 值：解链温度(Melting Temperature)4 4 样品采集、保存、运输和处理 4.1 样品采集 用棉拭子从犊牛直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约 20 g，装入一次性封口袋。每份样
4、品标记编号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址。4.2 样品保存和运输 采集的样品在 2-8条件下保存应不超过 72 h，长期保存需加入等体积 5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内 4保存。样品运输应放在一个不透水、防泄漏的容器内，将上述容器置于结实、不透水和DB1304/T4402023 2 防泄漏的辅助包装中。冷冻剂放在辅助包装周围，确保样品在 48 h 内送达实验室。4.3 样品的预处理 4.3.1 将经高压灭菌或 80-100烘烤 20 min 的 60 目-100 目铜筛网置于无菌漏斗中，放置在固定好的铁架台上，漏斗下端置于 50 mL 离心管中。取 10 g
5、待检样品（若是成形的粪便应混匀；若粪便含水量高，混匀后取 10 mL）放入烧杯中，加 30 mL PBS，玻璃棒或压舌板混匀后经 60 目-100 目铜筛网过滤至离心管中。4.3.2 滤液用移液器吸取 1.5 mL 放入 2 mL 离心管中，-20保存，用于 DNA 提取。4.3.3 剩余滤液 1500 r/min 离心 10 min，弃上清。沉淀加入等体积 5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内4 保存备用。5 操作程序 5.1 DNA 抽提 将保存于 2 mL 离心管中的样品以 1500 r/min 离心 5 min 后，弃上清，沉淀用于 DNA 的提取，按从粪便中提取 DNA 的商品化试剂盒说
6、明书进行操作。5.2 荧光定量 PCR 检测 5.2.1 荧光定量 PCR 反应体系的配制。在反应混合物配制区进行。从试剂保存盒中取出大肠杆菌和微小隐孢子虫的上下游引物及其探针、2FastFire qPCR PreMix，灭菌超纯水，在室温下融化后，3000 r/min 离心 5 s。设定 PCR 数为 n+2，其中 n 为待检样品数，加上一管阳性对照及一管阴性对照，每个样本测试反应体系配制（见附录 B）。计算好各试剂的使用量，加入一个适当体积的离心管中，向其中加入 12.5 L（n+3）的 2FastFire qPCR PreMix,大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物各 0.75 L（n+3），
7、大肠杆菌和微小隐孢子虫下游引物各 0.75 L（n+3），探针各 0.5 L（n+3），5.5 L（n+3）的灭菌去离子水并充分混合均匀。向每个定量 PCR 管中各分装 22 L，转移至样本处理区。5.2.2 加样 在样本加样区进行。在各设定的定量 PCR 管中分别加入 7.1 制备的未知样本 DNA 溶液各 3 L，盖紧管盖后，500 r/min 离心 30 s。5.2.3 荧光定量 PCR 扩增反应 在样本检测区进行。将本标准 7.2.2 加样后的 PCR 管放入荧光定量 PCR 检测仪内，记录样本摆放顺序。在 96 孔板记录或填写被检样品、阳性对照、阴性对照。设定双重荧光定量 PCR（探
8、针法）检测大肠杆菌和微小隐孢子虫的反应参数（见附录 B）。检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值判定结果。6 结果判定 6.1 结果分析条件设定 检测结果有效的条件需为：同时满足（1）阴性对照 FAM 通道和 HEX 通道检测无 Ct 值；（2）阳性对照 FAM 通道和 HEX 通道检测 Ct 值30。6.2 结果判定及描述 6.2.1 FAM 和 HEX 通道均检测 Ct 值40，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫混合感染。DB1304/T4402023 3 6.2.2 FAM 通道 Ct 值40，HEX 通道无 Ct 值，则判定样品为大肠杆菌感染阳性，微小隐孢子虫感染阴性。6.2.3
9、FAM 通道无 Ct 值，HEX 通道 Ct 值40，则判定样品为大肠杆菌感染阴性，微小隐孢子虫感染阳性。6.2.4 FAM 通道和 HEX 通道检测无 Ct 值，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫感染阴性。7 废弃物处理和防止污染的措施 废弃物处理和检验过程中防止交叉污染的措施，按照WS/T230-2002中第6章“污染的预防和控制”的规定执行（见附录C）。DB1304/T4402023 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂的配制 A.1 0.01mol/L7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）将 0.39 g NaH2PO4H2O、1.93 g Na2HPO47H2O 和 8.5 g NaCl
10、 溶解于 800 mL 蒸馏水，用 HCI 调节溶液的 pH 值至 7.2，加蒸馏水定容至 1000 mL，在 120高压下蒸汽灭菌 20 min，保存于室温。A.2 5%重铬酸钾溶液 将 5 g 重铬酸钾加入蒸馏水溶解，定容到 100 mL，并 120高压蒸汽灭菌 20 min，保存于室温。DB1304/T4402023 5 B B 附 录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 检测引物说明、反应条件及注意事项 B.1 引物说明 分别根据大肠杆菌和微小隐孢子虫 16SrRNA 和 18SrRNA 设计荧光定量 PCR（探针法）的特异性引物及其探针（分别为 FAM 和 HEX），引物 Tm 值在
11、55左右。B.2 双重荧光定量PCR反应体系 2FastFire qPCR PreMix 12.5 L，大肠杆菌和微小隐孢子虫上、下游引物各 0.75 L，探针各 0.5 L，DNA 模板 3 L，加 RNase-Free ddH2O 至反应体系总体积为 25 L。大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物、下游引物在所述试剂盒中的使用终浓度均为 0.3 M，各特异性荧光探针在试剂盒中的使用终浓度均为0.2 M。阴性对照选用 RNase-Free ddH2O。B.3 双重荧光定量PCR反应参数 95预变性 1 min；95变性 5 s，60退火 15 s，收集荧光信号，循环 95变性 5 s，60退火 1
12、5 s，收集荧光信号，共 40 个循环，结束反应；此反应程序可以使两种病原体的特异性引物在较短时间内对目的片段进行高效扩增，节约检测时间，确保了引物与模板特异性结合。B.4 使用中的注意事项 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。对于检测过程中，由于错误操作造成样品处理不当或者 DNA 提取不当，以及结果出现疑向时，可用保存于 5%重铬酸钾中的样品，充分混匀后取 1.5 mL 重新进行 DNA 提取和 PCR 扩增，以验证结果的可靠性。DB1304/T4402023 6 C C 附 录 C（规范性附录）检测过
13、程中防止交叉污染的措施 C.1 制样过程 制样工具应清洗干净，120 高压下蒸汽灭菌 20 min，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。C.2 检测过程 C.2.1 PCR 实验室应分为样品制备区、前 PCR 区、PCR 区和后 PCR 区。将模板提取、PCR 反应液配制、PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“洁净区”到“污染区”单向进行。C.2.2 实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。C.2.3 各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。C.2.4 所有溶液、水、耗材和器具要 120高压下蒸汽灭菌 20 min，避免核酸和/或核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在 20-25贮存的试剂中，可加入 0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。C.2.5 含有 DNA 模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。C.2.6 前 PCR 区，应在 PCR 操作台中加入 PCR 反应各组分。C.2.7 实验前后，用紫外线消毒以破坏残留的 DNA。C.2.8 可使用 dUTP/UDG 法控制污染。_
