1、 ICS 65.020.30 CCS B 40/49 四川省地方标准DB51/T 31282023 DB51畜禽遗传材料收集与保存技术规程2023-12-29 发布 2024-01-29 实施 四 川 省 市 场 监 督 管 理 局发布DB51/T 31282023 I目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 样品来源.2 5 样品信息登记.2 6 采集人员要求.2 7 采集保存方法.2 8 包装与运输.3 9 物流追踪和记录.3 10 安全管理.3 附录 A（规范性）畜禽遗传材料样本信息采集单.5 附录 B（规范性）畜禽遗传材料样本编码规则.6 附录 C
2、（规范性）畜禽样本采集量和储存方案.7 附录 D（规范性）猪冷冻精液生产技术操作规程.8 附录 E（规范性）家禽冷冻精液生产技术操作规程.11 DB51/T 31282023 II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川省畜牧总站。本文件主要起草人：曹伟，李强，王莉娟，刘园，张勇，洪宁，高慧纯，王小强，杨舒慧，葛桂华，余易展,刘政权。本文件为首次发布。DB51/T 31282023 1畜禽遗传材料收集
3、与保存技术规程1 范围 本文件规定了四川省畜禽遗传材料收集、整理与保存相关的样品来源、样品信息登记、采集人员要求、采集方法、包装与运输、安全管理、物流追踪和记录、样本信息管理。本文件适用于四川省畜禽遗传资源基因库、保种场、保护区等保种单位的畜禽遗传材料收集、整理与保存。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 2260 中国人民共和国行政区划代码GB/T 5458 液氮生物容器GB 13690 化学品分类和危险性公示 通则GB
4、19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 25172 猪常温精液生产与保存技术规范GBT 26938 牛体内胚胎生产与移植技术规程GB 50140 建筑灭火器配置设计规范AQ 3013 危险化学品从业单位安全标准化通用规范NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程NY/T 1900 畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NY/T 3186 羊冷冻精液生产技术规程NY/T 3444 牦牛冷冻精液生产技术规程NY/T 3458 种鸡人工授精技术规程NY/T 3796 马和驴冷冻精液NY/T 4047 家禽精液品质检测方法CNAS-CL05 实验室生物安全认可准则3
5、 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 畜禽遗传材料 livestock and poultry genetic material 畜禽遗传资源的胚胎、精液、卵子、细胞、毛发、DNA、RNA等遗传物质。3.2 生物安全 biosafety 国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人体健康和生态DB51/T 31282023 2系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。4 样品来源 国家畜禽遗传资源名录所列畜禽、蜂、蚕等遗传资源。5 样品信息登记 5.1 登记畜禽遗传材料样本信息采集单，记录样本类型、物种信息、采集地
6、、储存条件、采集人员等信息。参考附录 A。5.2 样品编号具有唯一性，并且长期使用，以保证信息的准确性。样品编号由 15 位字符、分五部分组成：4 位品种品系代码6 位行政区域代码（精确到区、县）3 位样品编号1 位性别代码1 位样品类型。参考附录 B。5.3 根据样本类型、用途，选择合适保存规格、最低保存数量、储存温度、储存类型。参考附录 C。6 采集人员要求 样品采集人员须接受专业培训，熟悉品种特性，掌握遗传材料采集方法、储存条件及管理、防护措施等。7 采集保存方法 7.1 精液采集保存 牛冷冻精液采集和保存参照NY/T 1234的规定执行；牦牛冷冻精液采集和保存参照NY/T 3444的规
7、定执行；绵羊和山羊冷冻精液采集和保存参照NY/T 3186的规定执行；马和驴冷冻精液采集和保存参照NY/T 3796的规定执行；猪冷冻精液采集和保存参照附录D；家禽冷冻精液采集和保存参照附录E。7.2 胚胎采集保存 牛胚胎采集和保存方法参照GBT 26938的规定执行；绵羊和山羊胚胎采集和保存方法参照NY/T 1571的规定执行；其它家畜胚胎采集和保存方法参照NY/T 1900的规定执行。7.3 卵子采集保存 家畜卵子采集和保存方法参照NY/T 1900的规定执行。7.4 细胞采集保存 畜禽体细胞的采集和保存方法参照NY/T 1900的规定执行。7.5 组织样品采集保存 7.5.1 活体采集保
8、存将畜禽保定后，利用取样器采集组织，放入冻存管或锡箔纸中，做好样本标记迅速放入液氮中保存。7.5.2 死亡动物样品采集保存 DB51/T 31282023 3动物死后2h内利用取样器采集组织，放入冻存管或锡箔纸中，做好样本标记迅速放入液氮中保存。7.5.3 用于细胞培养的组织样本采集 在取样后3 min内用PH7.0的PBS溶液对组织样本进行冲洗、迅速放入细胞保存液中，0-4 保存，24h内进行细胞培养。7.6 血液样品采集保存 7.6.1 将畜禽保定，对采血部位外进行局部消毒后，用采血针沿静脉缓慢刺入血管，待血液流出后收集在不同需求的采血管内，0-4暂存。7.6.2 需保存全血的样品，全血
9、0-4运输至保存单位后，保存于-80冰箱。7.6.3 需保存血清的样品，全血 0-4运输至保存单位，进行血清分离并分装后，保存于-80冰箱。7.6.4 需保存血浆的样品，新鲜全血置于含肝素、枸橼酸钠等抗凝剂的试管中，全血 0-4运输至保存单位后，进行血浆分离并分装后，保存于-80冰箱。7.7 毛发样本采集保存 畜禽保定后，对采集部位消毒后，分别采集背部、腹部、颈部、尾部的毛发（带毛囊）放入冻存管中，迅速放入液氮进行储存。8 包装与运输 8.1 包装 8.1.1 生物样本选用三层容器保存，即内层容器、第二层容器及外层容器。8.1.2 三层容器包装上注明样本类型、编号（采集编号和样本编号）、物种信
10、息、日期等标识。8.1.3 外层容器须坚固耐压，三层容器均须注意防水、防漏。8.2 运输 8.2.1 样本的运输由专人承担，运输方式根据样本类型、运输距离、时间、温度要求等条件决定。8.2.2 运输前确认运输方式、目的地、运输证明文件等。运输文件须包括样本信息采集单。8.2.3 恒温（16 18）运输的样本，使用专用恒温设备运输。低温（2 8）运输的样本，使用装有冰袋的泡沫箱或其它一些制冷剂保持 2 8运输；超低温（低于-30）条件运输的样本，用干冰保存运输；液氮条件下保存的样本，使用液氮罐进行运输，符合 GB/T 5458 的要求。8.2.4 对于运输过程中可能出现的问题，工作人员须提前准备
11、相关解决方案。9 物流追踪和记录 9.1 运输各个环节做好沟通、记录、追踪。9.2 装样运输时核查是否达到各种样品运送需要的防震、恒温和防照射等要求，接样时核查样品是否符合要求。10 安全管理 10.1 基本要求 DB51/T 31282023 4畜禽遗传材料保存单位制定相应的保存计划和质量管理、出入库管理、安全管理、消毒防疫、重大突发事件应急预案等制度，以及遗传材料制作、保存和质量检测技术规程。有完整系统的技术档案资料。10.2 消防安全 畜禽遗传材料保存单位防火系统须符合 GB 19489 的规定。畜禽遗传资源保种单位灭火器的配置符合 GB 50140 的规定。10.3 生物安全 畜禽遗传
12、材料保存单位在样本采集和使用前须进行生物安全评估。10.4 化学安全 畜禽遗传材料保存单位化学安全须符合 GB 13690 的规定，在使用到有毒有害物质的工作区域，须符合 AQ 3013 的规定。10.5 设备安全 畜禽遗传材料保存单位的设施及仪器设备须建立安全维护系统，除制定有序的设备维护、更换计划，定期进行设施的维护和检查外，还须制定相关仪器设备检定、校准计划并组织实施。相关设施设备的检修工作都须由专业技术人员来进行。10.6 环境安全 畜禽遗传材料保存单位放置干冰、液氮的地方要确保空气流通，安装氧气与二氧化碳检测装置。液氮储存装置须通过监控装备自动或手动记录每天的液氮用量与剩余量。相关人
13、员在操作干冰和液氮时，须做好防冻保护措施并佩戴专用的保护装备。10.7 信息安全 畜禽遗传材料保存单位须有统一、完整的信息管理系统，满足样本追踪、检索以及与其他数据系统兼容或关联的需求，须根据不同工作人员职责设置相应的权限。信息管理系统须建立安全保障措施，注意硬件防潮及信息防盗。AADB51/T 31282023 5附录A（规范性）畜禽遗传材料样本信息采集单A.1 畜禽遗传材料样本信息采集单畜禽遗传材料样本信息采集单见表A.1。表 A.1 畜禽遗传材料样本信息采集单 采集编号 样本类型 血液 组织 细胞 精液 胚胎 卵子 毛发 其他 物种信息 属 种 亚种 性别 繁殖方式 采集地 省/直辖市
14、市 县/区 具体地点 储存条件 4冰箱-20冰箱-80冰箱液氮 其他 采集人员 姓名 单位 日期 DB51/T 31282023 6附录B（规范性）畜禽遗传材料样本编码规则B.1 畜禽遗传材料样本编码规则畜禽遗传材料样本编码规则见表B.1。表 B.1 畜禽遗传材料样本编码规则 品种品系编码 行政区域代码 分管号 性别 类型 001-NNN F-雌性 D-DNA 001-NNN M-雄性 R-RNA 001-NNN C-细胞 001-NNN T-组织 001-NNN B-血液 001-NNN E-卵子 001-NNN EM-胚胎 001-NNN S-精子 001-NNN H-毛发 示例：CH01
15、51XXXX001FBCH01：成华猪51XXXX ：四川省 XX 市 XX 区001 ：第一管样本F ：雌性（Female）B ：血液（Blood）CH0151XXXX001FB 即成华猪在四川省 XX 市 XX 区采集的雌性第一管血液样本DB51/T 31282023 7附录C（规范性）畜禽样本采集量和储存方案C.1 畜禽样本采集量和储存方案畜禽样本采集量和储存方案见表C.1。表 C.1 畜禽样本采集量和储存方案 样本类型 保存规格 最低数量 储存条件 用途 血液 3-5 mL 3 管-80 冰箱 RNA/DNA/蛋白提取 组织 2-10 g 3 管-80 冰箱 RNA/DNA/蛋白提取
16、3 份 液氮 RNA/DNA/蛋白提取/建立细胞系 胚胎 单胎：1 枚 多胎：2 枚 200 份 液氮 动物扩繁、育种 卵子 单胎：1 枚 多胎：2 枚 200 份 液氮 动物扩繁、育种 精液 0.25 mL 猪：15000 管 牛：3000 管 羊：3000 管 液氮 动物授精、扩繁和育种 毛发 适量 3 管-80 冰箱 核 DNA 和线粒体 DNA 分析 DB51/T 31282023 8附录D（规范性）猪冷冻精液生产技术操作规程D.1 采精前准备D.1.1 种公猪 D.1.1.1 种公猪体型外貌和生产性能符合本品种标准，体质健康，系谱齐全。D.1.1.2 采精前先修剪种公猪阴毛至 2cm
17、 以下，刷拭公猪体表并清洗消毒。D.1.2 采精室 D.1.2.1 检查假台猪是否平稳，擦拭假台猪后半部。D.1.2.2 检查假台猪后方的防滑垫，防止公猪爬跨时打滑。D.1.2.3 对采精室清洗，并用紫外线消毒。D.1.2.4 采精室的温度须控制在 1525。D.2 采精采精操作按照 GB/T 25172 的规定进行。D.3 鲜精品质检测D.3.1 检测方法 检测方法按 GB/T 25172 的规定进行，并做好登记。D.3.2 质量要求 D.3.2.1 外观 淡乳白色或灰白色，均匀一致，无杂质。D.3.2.2 气味 略带腥味，无异味。D.3.2.3 精子活力 精子活力70%。D.3.2.4 精
18、子密度 精子密度1108 个/mL。D.3.2.5 精子畸形率 精子畸形率15%。D.4 鲜精处理D.4.1 预稀释 营养液(葡萄糖 1.5g、乳糖 3g、甘氨酸 0.8g，蒸馏水 100mL)先预热到 32，与鲜精 1：1 混合均匀。预稀释后的精液放入 17恒温箱内。D.4.2 离心 将预稀释精液装入 100mL500mL 的离心管或离心杯内，在 17和重力 800g 条件下离心 15minDB51/T 31282023 9后，弃上清液。D.4.3 稀释 冷冻稀释液(葡萄糖 6.12g、EDTA 0.3g、蒸馏水 75mL、蛋黄 20mL、甘油 5mL、乙二醇 0.83mL、青霉素和链霉素各
19、 1105 U)预热至 17，以精子密度不低于 4108 个/mL 计算冷冻稀释液添加量。先取2/3 冷冻稀释液加到离心管中，以吸吐方式混合均匀，装入专用器皿中，再用剩余冷冻稀释液冲洗离心管壁后合并。D.4.4 平衡 将盛放精液的器皿放入 17水浴杯中，一同放进 4冰箱，平衡 1.5h。D.4.5 分装 D.4.5.1 将精液分装到 0.25mL 或 0.5mL 细管中，标明生产单位、品种、种公猪号和生产日期。D.4.5.2 剔除有气泡、未灌满等不合格的细管精液。D.4.5.3 将分装好的细管精液铺放在冷冻支架上。D.5 冷冻D.5.1 冷冻方式 D.5.5.1 程序冷冻：程控冷冻仪的冷冻柜预
20、冷至 4，将细管放入冷冻柜。以 2/min 的速率，从 4下降至 1，以 30/min 的速率，从 1下降至-25，以 30/min 的速率从-25下降至-140，-140保持 15min。冷冻程序完成后将细管浸入液氮。D.5.5.2 熏蒸冷冻：将液氮倒入深度 50cm 以上的专用冷冻箱预冷 10min，保持冷冻支架高于液氮面2cm、熏蒸冷冻 8min。D.5.2 包装 将冷冻好的细管精液包装好，外包装上标明生产单位、品种、种公猪号、生产日期和支数等。D.5.3 保存 将包装好的细管精液放置液氮中保存。D.6 解冻解冻液（葡萄糖 3.7g、无水柠檬酸钠 0.6g、碳酸氢钠 0.125g、EDT
21、A 0.125g、氯化钾 0.075g，蒸馏水 100mL。)预热至 26。从液氮罐中快速取出 2 支3 支细管精液，放至 38水浴锅中 15s20s 或 50水浴锅中 7s 解冻。剪开细管精液封口端，挤入数滴精液至 1mL 解冻液中，搅匀，回温到 37，静置 20min。D.7 冻精品质检测D.7.1 检测方法 检测方法按 GB/T 25172 的规定进行，并做好登记。D.7.2 质量要求 D.7.2.1 精子活力 DB51/T 31282023 10精子活力30%。D.7.2.2 精子密度 精子密度4108 个/mL。D.7.2.3 精子畸形率 精子畸形率18%。D.7.2.4 细菌菌落数
22、 细菌菌落数800CFU/mL。D.8 生产记录做好冷冻精液生产全流程记录并存档。DB51/T 31282023 11附录E（规范性）家禽冷冻精液生产技术操作规程E.1 采精前准备E.1.1 种公禽 E.1.1.1 选择符合本品种标准，体质健康，系谱齐全的成年种公禽，单笼饲养3-4周，准备后续采精训练。E.1.1.2 配种前1-2周开始采精训练，每天训练1次，使公禽形成条件反射，训练可采取按摩法。E.1.1.3 正式采精前，需剪掉公禽泄殖腔周围直径5-7cm范围内的羽毛，并在3h-4h内不再喂水喂料。E.1.2 采精用具 参考NY/T 3458执行。E.1.3 采精室 E.1.3.1 采精环境
23、保持清洁无污染。E.1.3.2 环境温度保持在20-25。E.2 采精采精员右手手指夹住集精管（管口朝手背侧），掌心贴近公禽腹部，并快速抖动，左手掌掌心向下贴于公禽背部，从翼根向背腰部由轻渐重推至尾羽区，按摩数次，待公禽尾部翘起泄殖腔外翻，右手顺势将尾部向背部提起，用拇指和食指在泄殖腔外侧适当挤压。公禽排精时，翻转左手背，使集精管口向上接取精液。E.3 鲜精品质检测E.3.1 检测方法 参考NY/T 4047执行。E.3.2 质量要求 E.3.2.1 外观 乳白色不透明液体，整体均一。E.3.2.2 精子密度 精子密度10108个/mL。E.3.2.3 精子活力 精子活力65%。E.4 鲜精处
24、理E.4.1 稀释 稀释液（谷氨酸钠1.52g、柠檬酸三钾0.128g、乙酸镁0.08g、葡萄糖0.6g、1M氢氧化钠5.6mL、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸3.05g、pH7.1、蒸馏水100mL）预热后与精液1：1混合。DB51/T 31282023 12E.4.2 平衡 稀释后的精液放于2-5平衡，同时冷冻液（稀释液加终浓度10%-12%的甘油）放置在同样条件下预冷，平衡15min。之后将冷冻液与精液混合，2-5平衡10min。E.4.3 分装 E.4.3.1 将精液分装到 0.25mL 或 0.5mL 细管中，标明生产单位、品种、种禽号和生产日期。E.4.3.2 剔除有气泡
25、、未灌满等不合格的细管精液。E.4.3.3 将分装好的细管精液铺放在冷冻支架上。E.4.4 冷冻 E.4.4.1 液氮熏蒸法 将液氮倒入深度50cm 以上的专用冷冻箱预冷10min，保持冷冻支架高于液氮面2-6cm、熏蒸冷冻2-5min。E.4.4.2 程序冷冻法 程控冷冻仪的冷冻柜预冷至4，将细管放入冷冻柜。以 7/min的速率，从4下降至-35，以60/min的速率，从-35下降至-140，-140保持15min。冷冻程序完成后将细管浸入液氮。E.4.5 包装 将冷冻好的细管精液包装好，外包装上标明生产单位、品种、种禽号、生产日期和支数等。E.4.6 保存 将包装好的细管精液放置液氮中保存。E.4.7 解冻 细管从液氮中取出，浸入在2-4的冰水浴中1-2min解冻。E.5 冻精品质检测E.5.1 检测方法 参考NY/T 4047执行。E.5.2 质量要求 E.5.2.1 精子密度 精子密度8108个/mL。E.5.2.2 精子活力 精子活力40%。E.6 生产记录做好冷冻精液生产全流程记录并存档。
