1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 30152023 牛 5 种病毒性腹泻病的诊断和防治 技术规程 Technical specification for diagnosis and control of bovine viral diarrhea diseases 2023-02-07 发布2023-04-08 实施四川省市场监督管理局发 布 DB51/T 30152023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 诊断.2 5 防治措施.2 6 无害化处理.3 附录 A（规范性）牛 5 种腹泻病毒荧光定
2、量 PCR 检测方法及结果判定.4 DB51/T 30152023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：西南民族大学。本文件主要起草人：汤承、张焕容、任玉鹏、向华、岳华、王远微。本次为首次发布。DB51/T 30152023 1 牛 5 种病毒性腹泻病的诊断和防治技术规程 1 范围 本文件规定了牛病毒性腹泻黏膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒共5种病毒引起的牛病毒性腹泻
3、病诊断依据和防治技术。本文件适用于上述5种腹泻相关病毒的检测，牛病毒性腹泻病诊断、疫情处理、预防与控制。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18637-2018 牛病毒性腹泻粘膜病诊断技术规范 NY/T 541-2016 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛病毒性腹泻黏膜病 bovine viral diar
4、rhea mucosal disease 牛病毒性腹泻黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种病毒性传染病。BVDV可引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性感染等。该病为国家规定的二类动物疫病。3.2 牛冠状病毒病 bovine coronavirus disease 牛冠状病毒病是由牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）引起的新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻，也可导致各年龄段牛的呼吸道疾病。BCoV 还能感染家养和野生反刍动物。该病为国家规定的三类动物疫病。3.3 牛轮状病毒病
5、bovine rotavirus disease 牛轮状病毒病是由牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）引起的以呕吐、腹泻、脱水等为主要特征的人畜共患急性胃肠道传染病，尤其在幼龄动物中高发。该病已在全世界主要养牛国家和地区普遍发生和流行，给养牛业造成了严重的经济损失。3.4 牛纽布病毒病 niuniubu virus disease 牛纽布病毒病是由纽布病毒（Nebovirus,NeV）引起犊牛腹泻性疾病。感染犊牛可出现肠道损伤（尤其在十二指肠和空肠最严重）和严重腹泻。迄今为止，该病毒已在我国，以及英国、美国、韩国、日本、意大利、法国等十多个国家检出，具有广泛的地域分布。DB5
6、1/T 30152023 2 3.5 牛诺如病毒病 bovine norovirus disease 牛诺如病毒病是由牛诺如病毒（Bovine norovirus,BNoV）引起的一种犊牛腹泻性疾病。NoV属于杯状病毒科，诺如病毒属，是单链的 RNA 病毒，基因组全长7.3kb7.5kb。根据其基因组特征，可将NoV分为6个基因型，感染牛的主要为基因型。4 诊断 临床诊断 4.1 感染牛主要表现为体温升高，精神沉郁，食欲减退或废绝；多数病牛出现不同程度的腹泻，排出水样稀粪，内有气泡、粘液或血，气味恶臭；病牛甚至迅速脱水，死亡。根据以上临床症状进行疑似诊断。实验室诊断 4.2 4.2.1 样本采
7、集与处理 按照NY/T 541-2016 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范采集肛门棉拭子5g10g，置RNA保存液，-20及以下保存运输不超过48h，立即提取并反转录合成 cDNA。4.2.2 样本检测 依据本标准附录A中提供的牛病毒性腹泻粘膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒荧光定量PCR或恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法鉴定5种主要的牛腹泻相关病毒。诊断结果判定 4.3 4.3.1 可疑 有以上临床症状者，判定为可疑，进一步做实验室诊断。4.3.2 确诊 实验室诊断结果为阳性者，判定为确诊。5 防治措施 隔离 5.1 发现疑似疫情，立即隔离患病动物。消毒5.2
8、 对病牛污染的场所、用具、物品等彻底消毒。5.2.1 环境消毒 对牛舍地面和粪尿沟槽清洁后消毒。可采用3%5%来苏尔溶液喷雾消毒，20%生石灰粉涂墙和地面。饲养用具、牛栏、牛床等用5%10%的热碱水或3%的苛性钠溶液或35%来苏尔洗涤消毒，消毒后2h6h，放牛进入前用清水冲洗饲槽和牛床，待干燥后牛方可进入。运动场地清除粪便和杂草后，用5%10%的DB51/T 30152023 3 热碱水或者撒上生石灰消毒。病牛粪便应堆积在离牛舍较远、地势略低于牛舍处，避免由于雨水冲刷粪便导致其对牛舍的污染。5.2.2 产房消毒 产房每月进行一次定期消毒，且在临产牛生产前和产后各进行一次消毒。用3%5%来苏尔溶
9、液或其他消毒药按说明喷雾消毒。加强饲养管理 5.3 做好饲养管理工作，确保牧草供应充足，避免饲料发霉和变质，不饲喂被化学药物污染的干草。选择高质量牧草和饲料，要控制好牧草硬度，饲料应便于消化，做到蛋白质、维生素和矿物质等的科学搭配。可在饲料中添加微生态制剂调节胃肠道，或添加中草药以增强牛群免疫力。优化牛圈环境卫生情况，确保通风良好，清洁安全。治疗 5.4 5.4.1 对症治疗 采取补液、强心、止泻和防止细菌继发感染等措施治疗患病动物。5.4.1.1 补液 复方氯化钠或生理盐水，重症者输注5%葡萄糖生理盐水或一定量的10%低分子右旋糖酐补液。5.4.1.2 强心 在补液同时选用毛花苷C、洋地黄毒
10、苷、毒毛旋花苷K等强心剂强心。5.4.1.3 止泻 5.4.1.4 防止细菌继发感染 采用肌肉注射或静脉注射的方法。单一或联合使用喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类、磺胺类或酰胺醇类抗菌药物等12种防止细菌继发感染。5.4.2 特异性抗体治疗 发病初期若有相应的高免血清或卵黄抗体，可用其对发病牛进行紧急治疗。疫苗紧急免疫 5.5 若为牛病毒性腹泻黏膜病病毒感染引起的腹泻可采用其疫苗紧急免疫预防。其余病毒感染目前尚无商品化疫苗。6 无害化处理 患病牛及其产品按照农业部关于“病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号）”进行无害化处理。DB51/T 30152023 4 A A 附录A （规
11、范性）牛 5 种腹泻病毒荧光定量 PCR 检测方法及结果判定 A.1 引物及探针（10mol/L）NeV-F：5-CAGCCCGTCTGGGTGAAT-3；NeV-R：5-CTGGATRGTTCTGACTTCGG-3；BNoV-F：5-CCTYCACGGCGAGAAGTT-3 BNoV-R：5-CGGWGCGATGGTACAAARAT-3 BCoV-F：5-AGTAGTGTCAGTGCTAAC-3 BCoV-R：5-CAAGTGCCTGTAGGTATA-3 BCoV-Probe：5-FAM-ACAACTTCCATCCCGCCAAA-TAMRA-3 BVDV1-F：5-AAGCCTCGAGATG
12、CCACG-3；BVDV1-R：5-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3；BVDV1-Probe：5-FAM-CCCACAGCACATCTTAA-MGB3 BRV-F：GCTAACCACTTGGTATCCG BRV-R：GCCATCTGAGTGATTACTCTG BRV-Probe：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1 A.2 牛 5 种腹泻病毒荧光定量 PCR 检测方法及结果判定 A.2.1 NeV染料法荧光定量PCR检测 A.2.1.1 反应体系及条件 反应体系：TB Green Premix Ex Taq II 10L，上、下游引物各 1.0L，
13、cDNA模板1.5L，用DEPC H2O补齐到 20L。反应条件为：95 1min；95 15s、51 30s，共40个循环；熔解段 95 15s、60 1min、95，15s，1个循环，反应结束。A.2.1.2 结果判定 A.2.1.2.1 阈值设定 检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则是根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。A.2.1.2.2 质控标准 阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰
14、值。阳性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，表示样品中无病毒核酸，判定为阴性。Ct值35.0，出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88左右出现明显的峰值，表示样品中存在病毒核酸，判定为阳性。30.0Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值。阳性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，表示样品中无病毒核酸，判定为阴性。Ct值35.0，出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88左右出现明显的峰值，表示样品中存在病毒核酸，判定为阳性。30.0Ct值35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一
15、孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则判为阴性。A.2.3 BCoV探针法荧光定量PCR检测 A.2.3.1 反应体系及条件 PCR反应体系：Probe qPCR Premix Ex Taq 10L，探针0.4L（10mol/L），上下游引物各0.8L（10mol/L），cDNA模板2L，DEPC H2O补足到20L。反应程序为：95 min；95 15s，54 20s（采集荧光），40个循环。DB51/T 30152023 6 A.2.3.2 结果判定 A.2.3.2.1 阈值设定 阈值设定原则是根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。A.2.3.2.2
16、质量控制 阴性对照：FAM通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线，TAMRA通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线。阳性对照：FAM通道CT值35，TAMRA35，且2个通道扩增曲线均为典型的S型。阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。A.2.3.2.3 结果描述及判定 被检样本检测结果中 FAM 通道Ct值35，TAMRA 通道35，且扩增曲线均为典型的S曲线，报告为BCoV核酸阳性；35Ct值40，判定为可疑，可疑样品应重新检测，如重复后仍为35Ct值40，且扩增曲线均为典型的S曲线，报告为BCoV核酸阳性。被检样本检测结果中FAM和TAMRA通
17、道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线，报告为 BCoV 核酸阴性。A.2.4 BVDV 1型iiPCR检测 A.2.4.1 反应体系及条件 反应体系：Taq酶1 L，预混Buffer 25L，引物上下游各 3.5L（10molL-1），探针0.3L（10 molL-1），反转录酶1.5L（20UL-1），模板2 L，DEPC H2O 13.2L，共 50L。反应条件：42，30min，93，15s，60，1min，40个循环。反应信号由iiPCR仪光学探测模块自动识别，其反应结果通过系统默认的S/N值进行计算并被转化为“+”(positive)，“”(negative)和“？”(inconclu
18、sive)显示在屏幕上。A.2.4.2 结果判定 A.2.4.2.1 质量控制 阴性对照：经 iiPCR反应，结果显示为“-”。阳性对照：经 iiPCR反应，结果显示为“+”。阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。A.2.4.2.2 结果判定 被检样本检测结果中，iiPCR仪显示为“+”者判定为阳性；iiPCR仪显示为“-”判定为阴性。A.2.5 BRV iiPCR 检测 A.2.5.1 反应体系及条件 反应体系：Taq酶1L，预混Buffer25L，引物上下游各3.5L(10molL-1)、探针0.25L(10 molL-1)、反转录酶1.25L(
19、20UL-1)、模板2L、DEPC H2O 13.5L，共50L。反应条件：42，30min，93，15s，60，1min，40个循环。反应信号由iiPCR仪光学探测模块自动识别，其反应结果通过系DB51/T 30152023 7 统默认的S/N值进行计算并被转化为“+”(positive)，“”(negative)和“？”(inconclusive)显示在屏幕上。A.2.5.2 结果判定 A.2.5.2.1 质量控制 阴性对照：经 iiPCR 反应，结果显示为“-”。阳性对照：经 iiPCR 反应，结果显示为“+”。阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。A.2.5.2.2 结果判定 被检样本检测结果中，iiPCR仪显示为“+”者判定为阳性；iiPCR仪显示为“-”判定为阴性。
