1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 30142023 家畜螨病诊断与防控技术规范 Standard of dignositic and control techniques of livestock acariasis 2023-02-07 发布2023-04-08 实施四川省市场监督管理局发 布 DB51/T 30142023 I 目次 前言.II 1 范围.3 2 规范性引用文件.3 3 术语和定义.3 4诊断.3 5防治.7 附录 A（资料性）疥螨病临床症状.8 附录 B（资料性）痒螨病临床症状.9 附录 C（资料性）足螨病临床症状.10 附
2、录 D（资料性）虫体形态学.11 附录 E（规范性）ELISA 检测试剂配制和重组抗原制备.13 附录 F（规范性）PCR 检测试剂配制与 PCR 扩增结果参考.14 参考文献.15 DB51/T 30142023 II 前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川农业大学。本文件主要起草人：杨光友、古小彬、何冉、徐璟、谢跃。本次为首次发布。DB51/T 30142023 3 家畜螨病诊断与防控技术规范
3、1 范围 本文件规定了家畜螨病诊断与防控技术规范。本文件适用于家畜螨病的诊断、检疫与防治。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 36195-2018 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T5030-2016 无公害农产品 兽药使用准则 中华人民共和国兽药典 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 家畜螨病 livestock acariasis 由疥螨科（Sarcoptidae）的疥螨（Sarcoptes sc
4、abiei）和痒螨科（Psoroptidae）的痒螨（Psoroptes ovis）、足螨（Chorioptes）寄生于家畜（牛、羊、猪、兔和马）皮肤所引起的外寄生虫病的统称。3.2 疥螨病 sarcoptic mange 由疥螨（Sarcoptes scabiei）寄生于家畜皮肤表皮内引起相应的临床症状的外寄生虫病。3.3 痒螨病 psoroptic mange 由绵羊痒螨（Psoroptes ovis）寄生于家畜皮肤表面引起相应的临床症状的外寄生虫病。3.4 足螨病 choroptic mange 由牛足螨（Chorioptes bovis）和德州足螨（Chorioptes texanus
5、）寄生于家畜皮肤表面引起相应的临床症状的外寄生虫病。4 诊断 疥螨病、痒螨病和足螨病的临床症状 4.1 4.1.1 疥螨病 家畜疥螨病多始发于宿主皮肤柔软、被毛短而少的部位，主要以剧痒，结痂，皮肤增厚和畜体消瘦为主要临床特征，不同动物的发病部位存在差异（见附录A）。DB51/T 30142023 4 4.1.2 痒螨病 家畜痒螨病多始发生于毛浓密的部位，主要以瘙痒，结痂，脱毛和畜体消瘦为主要临床特征，不同动物的发病部位存在差异（见附录B）。4.1.3 足螨病 家畜足螨病多始发生于皮肤细嫩的部位，主要以瘙痒，结痂和患处脱毛为主要临床特征，不同动物的发病部位存在差异（见附录C）。疥螨病、痒螨病和足
6、螨病的显微镜镜检 4.2 4.2.1 病料的采集 4.2.1.1 疥螨病病料的采集剪去患病部和健康部皮肤交界处的毛后，采用经火焰消毒后的小刀垂直于皮肤面用力刮取交界处痂皮，直至刮处皮肤微有出血痕迹，将刮取物收集到容器内，待检。刮破处皮肤用碘伏等消毒剂进行消毒处理。4.2.1.2 痒螨病病料的采集用消毒小刀刮取患病部皮肤表面的痂皮，将痂皮收集到容器内，待检。取痂皮处皮肤用碘伏等消毒剂进行消毒处理。4.2.1.3 足螨病病料的采集用消毒小刀用力刮取患病部皮肤表面的痂皮，将痂皮收集到容器内，待检。取痂皮处皮肤用碘伏等消毒剂进行消毒处理。4.2.2 显微镜镜检4.2.2.1 热源法将 4.2.1 采集
7、的病料放入平皿内，将平皿放入 2537的恒温箱中 0.5h1h 后，将平皿置于显微镜下检查。4.2.2.2 直接涂片法将4.2.1采集的病料放置于载玻片上，滴加1滴5%甘油（丙三醇）水溶液，加盖另一新的载玻片，搓压载玻片至病料散开，移去病料上方的载载片，加盖玻片后，置显微镜下检查。4.2.2.3 浓集法当螨虫数量较少或病料采自死亡家畜时，可采用浓集法收集螨虫镜检。将4.2.1刮取的较多病料放入10%氢氧化钠溶液并浸泡过夜或加热煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min，取沉淀物镜检。或将上述沉淀物转入试管中，再加入60%硫代硫酸钠溶液，试管口加盖玻片，静置5min10min后，取盖玻片镜检。4
8、.2.3 镜检结果判定 4.2.3.1 病料中镜检到疥螨虫体或虫卵（见附录 D.1），判定为显微镜镜检阳性。4.2.3.2 病料中镜检到绵羊痒螨虫体或虫卵（见附录 D.2），判定为显微镜镜检阳性。4.2.3.3 病料中镜检到足螨虫体或虫卵（见附录 D.3），判定为显微镜镜检阳性。DB51/T 30142023 5 疥螨病和痒螨病的间接 ELISA 抗体检测 4.3 4.3.1 材料准备 4.3.1.1 试剂碳酸盐缓冲液（0.05M,pH 9.6）、PBS缓冲液（0.01M,pH 7.4）、PBST缓冲液（0.01M,pH 7.4）、2M硫酸（2M H2SO4）、LB液体培养基的配制见附录E.1
9、。辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗：HRP-羊抗牛IgG，用于检测牛血清；HRP-兔抗羊IgG，用于检测羊血清；HRP-羊抗猪IgG，用于检测猪血清；HRP-羊抗兔IgG，用于检测兔血清；HRP-兔抗马IgG，用于检测马血清。4.3.1.2 阳性血清和阴性血清对照样品疥螨阳性血清采自经显微镜镜检到疥螨虫体或虫卵的动物血清；疥螨阴性血清采自无疥螨流行史且经显微镜镜检呈阴性的动物血清。痒螨阳性血清采自经显微镜镜检到痒螨虫体或虫卵的动物血清；痒螨阴性血清采自无痒螨流行史且经显微镜镜检呈阴性的动物血清。4.3.1.3 重组抗原制备疥螨烯醇化酶重组抗原（rSar-Eno）和痒螨丝氨酸蛋白酶抑制剂重组抗
10、原（rPsoc 27）按照附录E.2制备。4.3.2 操作步骤 4.3.2.1 抗原包被用碳酸盐缓冲液将抗原稀释到最佳浓度（rSar-Eno14.5g/mL，rPsoc2746.0g/mL）后加入96孔聚乙烯板，每孔100L，4包被过夜。次日，弃孔内液体，每孔加入PBST缓冲液300L，洗板3次，每次 min，拍干。4.3.2.2 加封闭液每孔加5%脱脂奶粉（W/V，5g脱脂奶粉+100mL PBS）300L，37封闭1.5h。弃孔内液体，洗涤同4.3.2.1。4.3.2.3 加血清样品每孔加入用PBS缓冲液稀释的待检血清100L（rSar-Eno以1:640倍稀释；rPsoc 27以1:10
11、0倍稀释），每板同时设置标准阳性血清对照孔、标准阴性血清对照孔以及空白（稀释液）对照孔。37温育1h后，弃孔内血清，洗涤同4.3.2.1。4.3.2.4 加酶标二抗用PBS缓冲液将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释至推荐工作浓度，加入100L，37温育1h。弃孔内液体，洗涤同4.3.2.1。4.3.2.5 加底物显色每孔加入底物TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）溶液100L，37避光温育20min。4.3.2.6 终止反应DB51/T 30142023 6 每孔加入2M硫酸（H2SO4）50L终止反应，20min内用酶标仪测定结果。4.3.2.7 ELISA 检测结果判定以空白孔调零，
12、用酶标仪测定450nm的吸光值（OD450值），若阳性对照OD450值/阴性对照OD450值的比值大于2.1,则实验结果成立。P为待检血清孔OD450值，N为阴性对照孔OD450值，以P/N2.1判为阳性，P/N2.1判为阴性。疥螨病的 PCR 检测 4.4 4.4.1 材料的准备 4.4.2 试剂 1TAE缓冲液（见附录F.1）；微量基因组DNA提取试剂盒；DL2000DNA Marker、灭菌ddH2O、2Taq PCR MasterMix II；GoldView II核酸染料。4.4.2.1 对照样品和待检样品 通过热源法从4.2.1.1采集的疥螨病病料中分离获得疥螨虫体，按微量基因组D
13、NA提取试剂盒的说明书方法提取疥螨虫体的基因组DNA，从而获得疥螨DNA阳性对照样品。采用4.2.1.1方法采集病料获得待检样品。4.4.3 DNA 提取将4.4.2.1的待检样品放入预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末，再用商品化的微量基因组DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA，获得的DNA立即进行后续PCR扩增或放入-20保存备用。4.4.4 PCR 扩增扩增总体积为25L，包括PCR Mixture 12.5L，待检样品DNA模板1.0L，上、下游引物各1.0L（10 pmol/L,引物序列5-GTGTGGAACTGGTAGAGG-3，5-CAGATCAAGCAAAAAGAGTT AAG-
14、3），灭菌蒸馏水加至25.0L。同时设置疥螨DNA的阳性对照组和设置灭菌蒸馏水的阴性对照组。扩增条件如下：94C预变性3min；94 C变性30 s,54C复性20 s，72 C延伸20 s，35个循环；72C延伸8min；8储存10min。产物预期大小为212bp。4.4.5 琼脂糖凝胶电泳和成像 4.4.5.1 制板将1.6g琼脂糖放入8 mL1TAE缓冲液中，加热融化，待温度降至56左右，加入GoldView II核酸染料8L，倒入预先放置好的制胶台，插上梳子，厚度约3mm5mm。4.4.5.2 加样与电泳取6L PCR产物（包括待检样品、阳性对照、阴性对照）及5L DL2000 DNA
15、 Marker加入凝胶孔内，经5V/cm电泳，电泳30min，于紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统中观察结果，并拍照保存。4.4.6 PCR 检测结果判定 实验结果成立条件：当阳性对照出现212bp的特异性条带，且阴性对照未扩增条带。在实验结果成立的情况下，待检样品出现212bp的条带，则判定为疥螨核酸阳性（见附录F.2）。DB51/T 30142023 7 若需要进一步确认检测结果，可将电泳检测呈阳性的PCR剩余产物送公司进行测序，PCR扩增的疥螨COX1基因参考序列长212bp（见附录F.3）。综合判定4.5 4.5.1 疑似患病动物符合4.1.1或4.3.2.7阳性，判为疑似疥螨病；符合4.1
16、.2或4.3.2.7阳性，判为疑似痒螨病；符合4.1.3，判为疑似足螨病。4.5.2 确诊患病动物符合4.2.3.1或4.4.6阳性，判为疥螨病患病动物。符合4.2.3.2阳性，判为痒螨病患病动物。符合4.2.3.3阳性，判为足螨病患病动物。5 防治 预防 5.1 5.1.1 保持畜舍清洁干燥、通风、透光、不拥挤。5.1.2 新引进的家畜，严格执行落地隔离观察 15 天30 天，采用本文件中“4 诊断”规定的方法确诊无螨后方能合群。5.1.3 螨病常发地区，定期对家畜采用本文件中“4 诊断”规定的方法进行检查，一旦发现可疑家畜，立即隔离治疗，并使用外用杀虫药物对圈舍进行杀螨处理。5.1.4 养
17、殖场严格使用药物进行定期驱虫。可选用伊维菌素、多拉菌素等药物，按药物生产厂家推荐的用量与用法规范使用。5.1.5 放牧家畜螨病的预防可在每年春、秋两季选用氰戊菊酯、双甲脒和二嗪农等外用杀虫药物进行药浴或喷淋，按药物生产厂家推荐的用量与用法规范使用。5.1.6 圈舍、饲养用具及周围环境定期使用氰戊菊酯、双甲脒和二嗪农等外用杀虫药物进行杀螨处理，按药物生产厂家推荐的用量与用法规范使用。对小型笼舍还可采用火焰喷烧进行杀螨处理。5.1.7 肉用或乳用家畜使用杀螨药物进行预防时要严格注意其休药期。5.1.8 圈舍垫料、毛发等废弃物进行集中堆积发酵等方式杀灭螨虫或虫卵处理，具体按照 GB/T 36195-
18、2018 规定的方法进行。治疗 5.2 5.2.1 确诊患螨病的动物可采用化学药物进行治疗，药物的选择应符合中华人民共和国兽药典规定，药物的使用按照 NY/T5030-2016 执行。5.2.2 可选用伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素等进行治疗，按药物生产厂家推荐的用量与用法规范使用。5.2.3 可选用氰戊菊酯、双甲脒和二嗪农等外用杀虫药物进行喷淋或药浴治疗，按药物生产厂家推荐的用量与用法规范使用。DB51/T 30142023 8 A A 附录A （资料性）疥螨病临床症状 A.1 牛 皮肤病变常见于肩部、颈背部、尾根部、臀部、头部及四肢，严重时可波及全身。A.2 羊 绵羊：始发于嘴唇四周、角两侧
19、、鼻边缘和耳根部，严重时蔓延至整个头部及颈部，其中以头部出现症状最明显。病变部可形成坚硬的灰白色痂皮，故俗称“石灰头”。山羊：多发生在被毛稀疏的皮肤，如嘴唇四周、眼圈、鼻梁和耳根部，严重时可蔓延到腋下、腹下和四肢曲面，甚至全身。病羊出现烦燥不安、剧痒，被毛脱落，病变部位逐步向四周延伸、扩大，皮肤增厚，形成皱褶和龟裂。A.3 猪 各种年龄和品种的猪均可感染，临床症状主要表现为两种类型：皮肤过敏反应型：常见于乳猪和保育猪，主要是由螨虫引起的迟发型和速发型超敏反应。常起始于眼周、颊部和耳根，后蔓延至背部、躯干两侧、后肢内侧及全身。病猪出现剧痒，到处摩擦或以蹄搔弹患部，至摩擦部出血，患部脱毛、结痂、皮
20、肤增厚，形成皱褶和龟裂。皮肤角化过度型：又称为慢性疥螨病，常见于经产母猪、种公猪和成年猪。由于出现皮肤过度角质化和结缔组织增生，病猪皮肤变厚，形成大的皮肤皱褶、龟裂、脱毛，被毛粗糙多屑，常见成年猪耳廓内侧、颈部周围、四肢下部，尤其是踝关节处形成灰色、松动的厚痂，经常用蹄挠痒或在墙壁、栏栅上摩擦皮肤，造成脱毛和皮肤损坏、开裂和出血。A.4 兔 皮肤病变常发于四肢，后蔓延至嘴及鼻周围等处。A.5 马皮肤病变始发于头部、体侧、躯干及颈部，后蔓延至肩部、髻甲及全身。DB51/T 30142023 9 B B 附录B（资料性）痒螨病临床症状 B.1 牛 黄牛、奶牛和牦牛：患牛临床上皮损区皮肤发红，皮损区
21、出现淡黄色的结痂，中等感染病例出现鳞状皮屑；皮损区多出现在尾根、背部和肩胛部，严重病例皮损区可蔓延到全身。患牛奇痒，常在木柱等物体上摩擦，或用舌舔吮患部，皮肤损伤，脱毛，渗出液凝固形成痂皮。皮肤增厚，失去弹性。水牛：水牛的痒螨病发病部位、临床症状与黄牛、奶牛和牦牛的痒螨病相似，但形成的痂皮较薄，呈“油漆起爆”状，痂皮薄似纸，表面平整，一端稍微翘起，另一端则与皮肤紧贴。若揭开痂皮，可见许多仍在爬动的黄白色的螨虫。B.2 羊 绵羊：初始发于背部和臀部，后很快地蔓延到体侧。初期，患羊呈现轻度至中度瘙痒，表现为晃头、后肢搔抓患部、在木柱、墙壁等处擦痒，皮损区形成结节，后形成浅黄色脂肪样的痂皮；随病程加
22、重，瘙痒加剧，患羊体上的毛结成束或躯体下部泥泞不清洁，后零散的毛丛悬垂在羊体上，最后毛束逐渐地大片脱落，甚至全身脱光。病羊呈现贫血症状，高度营养障碍，在寒冷季节，加上皮肤脱毛，可引起绵羊的大批死亡。山羊：多发生于耳壳内面。病羊食欲不佳，常摇动耳朵；病变部发痒，常在硬物上摩擦。患部形成硬而坚实、紧贴皮肤的黄白色痂皮块，炎症常蔓延至外耳道。B.3 兔 兔患病时主要发生在外耳道内，可引起猛烈的外耳道炎；盯聍过盛分泌，干涸成痂，厚厚地嵌在耳道内如纸卷样，甚至完全堵塞耳道；耳变重下垂；病变部发痒，病兔摇头，搔耳；还可能延至筛骨及脑部，引起癫痫发作。B.4 马 常发生于鬃部、鬣部、尾部、颌间部、股内侧及鼠
23、蹊部。患部盖有浅黄色脂肪样的柔软痂皮，容易剥离；邻近的皮肤亦迅速脱毛；乘马及挽马常发生于装置鞍具、颈套、鞍褥的部位。DB51/T 30142023 10 C C 附录C（资料性）足螨病临床症状 C.1 牛 牛（黄牛、奶牛、牦牛和水牛）常初始发于尾根部和尾根部两侧的凹槽，皮损处覆盖干燥的细白色鳞片，皮损区发痒，后皮损区可蔓延到会阴、大腿内侧，甚至蔓延到骶部和背部或乳房；严重病例，在皮损区呈现厚的结痂，瘙痒明显。C.2 羊 绵羊：主要寄生于绵羊的蹄部及腿外侧 山羊：主要寄生于山羊的颈部、耳及尾根等处。C.3 马 马的足螨寄生于马的肛周皱褶、后肢远端及尾部等处。DB51/T 30142023 11
24、D D 附录D（资料性）虫体形态学D.1 疥螨（Sarcoptes scabiei）分类上属于疥螨科（Sarcoptidae）的疥螨属（Sarcoptes），为雌雄异体，虫体可分为假头和躯体两部分，身体上有横、斜的皱纹。假头位于虫体前端，短而宽，有一呈蹄铁形的咀嚼式口器。虫体背面前端有一几丁质胸甲，呈长方形；末端正中有一肛门；两侧有对称的刚毛；体表有大量的波状皮纹、三角形鳞片、棒状刺。虫体腹面有4对粗短、呈圆锥形的足；前2对足向前伸，比后足长，可从背面看见，位于虫体前1/3；后2对足伸向后方，短，从背面不能见到，位于虫体后1/3（见图D.1）。雄螨：虫体大小为200微米300微米150微米20
25、0微米，第1、2、4对足上有吸盘，第3对足上仅有一根长刚毛；生殖孔位于虫体第4对足之间，周围有呈倒“V”字形的几丁质构造。雌螨：虫体大小为300微米500微米250微米400微米。第1、2对足上有吸盘，第3、4对足上各有一根长刚毛；生殖孔（产卵孔）位于虫体腹面中央，近末端有一阴道。图D.1 疥螨（左：成螨背面观；右：成年雌螨腹面观）D.2 绵羊痒螨（Psoroptes ovis）分类上属于痒螨科（Psoroptidae）的痒螨属（Psoroptes）的螨虫，其成螨虫体大小500微米900微米200微米520微米，肉眼可见，虫体可分为假头和躯体两部份。假头位于虫体前端，其基部背面后方无粗短垂直刚
26、毛，由呈圆锥形的刺吸式口器，较长。躯体背面表皮有细皱纹；虫体透明的淡褐色角皮上有稀疏的刚毛和细皱纹。肛门位于躯体末端。足较长，特别是前两对足较后两对足粗大。雄螨：第1、2、3对足上有吸盘，吸盘位于分三节的柄上，第4对足特别短，无刚毛和吸盘。躯体末端有两个大结节，上有长刚毛数根；腹面后部有两个吸盘；生殖器居于第4基节之间。雄螨有性吸盘和尾突（见图D.2）。雌螨：第1、2、4对足上有吸盘，第3对足上各有两根长刚毛。躯体腹面前部有一个宽阔的生殖孔，后端有纵裂的阴道；躯体末端为肛门（见图D.2）。DB51/T 30142023 12 图D.2 绵羊痒螨（左：雄螨腹面观；右：雌螨背面观）D.3 足螨（C
27、horioptes）分类上属于痒螨科（Psoroptidae）的足螨属（Chorioptes）的螨虫，其成螨体长300微米500微米，虫体分为假头和躯体两个部分。假头由背面的1对螯肢、1对须肢和1个口下板组成。虫体体表有细纹；口器较短，呈锥形；足长，跗节吸盘的柄短而不分节；肛门位于虫体末端（见图D.3）。雌螨：4对足，第1、2、4对足上有吸盘，第3对足上有刚毛。雄螨：4对足，第1、2、3、4对足上均有吸盘，第4对足极短，从背面不能被看见。生殖孔位于第3、4对足之间。体末端有2个结节，结节的前方腹面有1对环状性吸盘，性吸盘上有刚毛。图D.3 足螨（雌螨）背面观 DB51/T 30142023 1
28、3 E E 附录E（规范性）ELISA 检测试剂配制和重组抗原制备E.1 ELISA 检测试剂配制 E.1.1 碳酸盐缓冲液（0.05M pH 9.6）Na2CO3 7.95g；NaHCO3 1.465g，加少量去离子水溶解，调节pH至9.6，定容至500mL。E.1.2 PBST缓冲液（0.01M PBS+0.05%Tween-20,pH 7.4）KH2PO4 0.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，NaCl8.0gKCl0.2g，500LTween-20,ddH2O 定容至1 L，常温放置备用。E.1.3 PBS缓冲液（0.01M PBS,pH 7.4）KH2PO4 0.2g，Na2
29、HPO412H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，ddH2O定容至1000mL，常温放置备用。E.1.4 2M硫酸（2M H2SO4）10mL 98%浓硫酸溶液加入60mL ddH2O中，定容至100mL，室温保存。E.1.5 LB液体培养基 Trypton 5g，Yeast Extract 10g，NaCl 5g，ddH2O定容至1000mL，高压灭菌备用。E.2 疥螨烯醇化酶重组抗原（rSar-Eno）和痒螨丝氨酸蛋白酶抑制剂重组抗原（rPsoc 27）的制备 E.2.1 疥螨烯醇化酶重组抗原（rSar-Eno）的制备 采 用 RT-PCR 方 法 从 兔 源 疥 螨 c
30、DNA 文 库 中 扩 增 疥 螨 Sar-Eno 基 因（引 物 序 列：F，5-CGGATCCATGTCCATCAAAAAGATCTACGC-3；R：5-CGAGCTCTCAAACTGGGTGGCGGA-3），将目的片段连接到pET32a(+)载体，并经公司测序核实序列正确后转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，采用1.0 mM IPTG 37诱导8 h后，采用SDS-PAGE电泳验证表达情况（rSar-Eno约65kDa）。进一步将正确表达的菌株扩大培养和诱导表达，将菌液离心、超声破碎、镍柱纯化、透析及超滤后，获得纯化后的疥螨重组烯醇化酶蛋白（rSar-Eno），采用BCA试剂盒测定
31、蛋白浓度后，分装保存于-80备用。E.2.2 痒螨丝氨酸蛋白酶抑制剂重组抗原（rPsoc 27）的制备 采 用 RT-PCR 方 法 从 绵 羊 痒 螨 cDNA 文 库 中 扩 增 Psoc 27 基 因（引 物 序 列：F，5-CGGGATCC GCTCATGTTGGTCAACATC-3；R：5-CCAAGCTTTTAAAAATCATGAATTTCACC-3），将目的片段连接到pET32a(+)载体，并经公司测序核实序列正确后转化进大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞，采用1.0 mM IPTG 37诱导8h后，采用SDS-PAGE电泳验证表达情况（rPsoc 27约75 kDa）。进一
32、步将正确表达的菌株扩大培养和诱导表达，将菌液离心、超声破碎、镍柱纯化、透析及超滤后，获得纯化后的绵羊痒螨重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白（rPsoc 27），采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，分装保存于-80备用。DB51/T 30142023 14 FF附录F（规范性）PCR 检测试剂配制与 PCR 扩增结果参考F.1 PCR 检测试剂配制 1TAE缓冲液：首先配制50TAE Buffer：称量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g 于1 L烧杯中；向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解；加去离子水定容至1L后，室温保存。按照1:100的
33、比例，在10mL 50TAE Buffer加入490 mLddH2O，配制为1TAE缓冲液 F.2 疥螨病的 PCR 检测结果判定参考图 PCR方法标准阳性扩增结果见图F.1 图F.1 PCR 方法标准阳性扩增结果注：M.DL2000 标准分子量（TakaRa）；1.标准阳性扩增结果；2.阴性对照 F.3 疥螨 COX1 基因序列 GTGTGGAACTGGTAGAGGAACTGGCTGAACTATTTATCCTCCTTTATCTAGAATCACTTATCATTCAAATATGTCTGTAGATTTTACAATTGTAAGATTACATATTGCTGGAATTTCTTCTATTTTAAGTTCT
34、ATCAATTTTATTGTAACTATTTATAATATAAAAATAAAAGGAATAAGATGATCAAACTTAACTCTTTTTGCTTGATCTG DB51/T 30142023 15 参考文献1 郝桂英,杨光友,赖松家,等.兔螨净等3种杀虫药物对离体兔痒螨的杀灭试验.中国兽医杂志,2006,42(6):34-35.2 张晓谦,杨光友,古小彬,等.黄牛足螨的形态学观察.中国兽医科学,2006,36(10):827-831.3 古 小 彬,杨 光 友,郝 桂 英.三 种 杀 螨 药 对 离 体 兔 疥 螨 的 杀 灭 试 验.黑 龙 江 畜 牧 兽医,2006,10:99-100.4
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