1、 ICS 65.020.30 CCS B 40/49 DB51 四川省地方标准 DB51/T 30112023 山羊胚胎生产与冷冻保存技术规范 2023-02-07 发布2023-04-08 实施四川省市场监督管理局发 布 DB51/T 30112023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 胚胎生产.1 5 胚胎质量检测.4 6 胚胎冷冻保存.4 7 解冻.5 附录 A（资料性）各种液体配制.6 附录 B（资料性）胚胎装管示意图.8 附录 C（资料性）检胚记录表.9 DB51/T 30112023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标
2、准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口和解释。本文件主要起草单位：四川省畜牧总站、四川农业大学。本文件主要起草人：杨舒慧、张明、张红平、李强、王小强、曹伟、周光斌、曾长军、程莲、洪宁、王莉娟、张勇。本次为首次发布。DB51/T 30112023 1 山羊胚胎生产与冷冻保存技术规范 1 范围 本文件规定了山羊胚胎生产与冷冻保存的术语和定义、胚胎生产、质量检测、冷冻及解冻的技术要求。本文件适用山羊胚胎生产与冷冻保存。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性
3、引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 超数排卵 Superovulation 利用外源性促性腺激素诱发母羊卵巢多个卵泡发育，并排出多个具有受精能力的卵子的方法。3.2 体外受精 In vitro fertilization 山羊的精子和卵子在人工控制的体外环境中完成受精过程。3.3 玻璃化冷冻 Vitrification 利用含有高浓度的渗透性抗
4、冻保护剂溶液处理胚胎，然后将胚胎装入冷冻载体并直接投入液氮快速降温，使液体形成玻璃态，可有效减少冷冻过程中有害冰晶的形成，使胚胎所受物理性伤害大大降低的一种胚胎冷冻方法。3.4 慢速降温冷冻 Slow-freezing 利用含有低浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎，然后将胚胎装入冷冻载体并按照一定程序于程序冷冻仪中植冰和降温，最后置于液氮中保存的一种冷冻方法。3.5 体外受精胚 in vitro-fertilized embryo 通过体外受精获得的胚胎。4 胚胎生产 DB51/T 30112023 2 超数排卵胚生产 4.1 4.1.1 药品与器械的准备 孕酮阴道栓（CIDR）、氯前列烯醇（
5、PGF2）、促卵泡素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）（或促黄体素（LH），或促排3号）、青霉素、链霉素、复合麻醉剂、PBS液（附录A1）、冲胚液（附录A2）、胚胎操作液（附录A3）、生理盐水、75%酒精、碘酊；手术台、植栓枪、羊用冲胚管、滞留针（18G）、手术剪、手术刀、止血钳、缝针（圆针、三棱针）、外科手术缝线、注射器、体视显微镜、恒温台、检胚皿、培养皿 4.1.2 供体母羊选择 所选用供体母羊必须符合品种要求或标准（有国标或地标的品种，参照品种标准），连续三代内系谱清楚、健康无病，发育到性成熟后，繁殖机能正常的个体。4.1.3 饲养管理 保持饲养环境适宜、卫生、温度稳定，避免应激；
6、制定合理的供体羊日粮配方，保证蛋白质、能量、维生素和微量元素等营养平衡，保持中等膘情；供给清洁饮水，适当运动。4.1.4 超数排卵 用植栓枪将CIDR（含孕酮300mg500mg）放入供体母羊阴道内，放置CIDR之日为0d，第9d第二次补栓，第15d起早晚间隔12h肌肉注射FSH，注射总量100IU200IU（或10mg15mg），每天按照总量的5:3:2递减连续注射3d，第16d上午注射完FSH后立即撤CIDR，同时注射氯前列烯醇2ml。孕酮、FSH具体计量见下表：孕酮、FSH具体计量见表1。表1 孕酮、FSH 具体计量 体型品种 CIDR中孕酮 FSH 地方品种培育品种地方品种培育品种大型
7、500mg400mg200IU/15mg150IU/13mg中型450mg350mg175IU/13.5mg125IU/11.5mg小型400mg300mg150IU/12mg100IU/10mg4.1.5 发情鉴定与诱导排卵 注射完FSH后，观察母羊发情情况。对有发情征兆的母羊，采用公羊试情，以供体母羊愿意接受试情公羊爬跨，判断为发情。做好发情时间记录，同时静脉注射HCG 500IU800IU，或肌注LH 50IU100IU，或肌注促排3号10g20g。诱导排卵激素具体剂量见下表：诱导排卵激素具体剂量见表1。表2 诱导排卵激素具体剂量 体型品种 HCGLH促排3号地方品种培育品种地方品种培育
8、品种地方品种培育品种大型800 IU700IU100IU80 IU20g16g中型700 IU600IU85IU65 IU18g14g小型600 IU500IU70IU50 IU16g10gDB51/T 30112023 3 4.1.6 配种 可采用自然交配或人工授精进行发情母羊的配种。自然交配配种2次，人工授精输精3次。发情时立即配种1次，每间隔12h再配第2或第3次。人工授精，可使用鲜精或冻精，鲜精活力0.7以上，冻精解冻后活力0.3，每次输精有效精子数不低于3107个，输精容积0.5ml1ml。4.1.7 手术冲胚 采用NY/T 1571中5.1部分。体外受精胚生产 4.2 4.2.1
9、药品和器械的准备 超数排卵药品、消毒药品、外科手术器械和常用器械见4.1.1。肝素、卵母细胞体外成熟培养液、体外受精液、早期胚胎体外培养液；CO2培养箱、CO2钢瓶、超净工作台。4.2.2 卵母细胞收集 4.2.2.1 活体取卵 按照4.1.2选择供体母羊，按照4.1.4对供体母羊进行超数排卵处理。在第6次注射FSH前12h禁食，最后1次FSH注射12h，参见NY/T 1571中5.1中外科手术方法暴露卵巢，用生理盐水浸润的纱布包裹卵巢，用预吸有抽卵液（附录A4），用带12号针头的5 ml注射器抽吸卵巢上所有直径3mm6 mm的有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体（COCs）和卵泡液，抽吸完后将抽吸
10、物盛在直径60 mm的培养皿中。4.2.2.2 屠宰场收集卵巢 选择符合品种要求、系谱清楚的淘汰母羊，屠宰后收集卵巢，放入含有1000 IU/ml青霉素和1000g/ml链霉素的生理盐水或PBS液的保温瓶中，4h内送回实验室，然后参见4.2.2.1中的方法抽吸卵母细胞。4.2.3 卵母细胞体外成熟 用卵母细胞成熟培养液（附录A5）于直径35mm培养皿中制作60l80l微滴，覆盖矿物油将，在CO2培养箱中平衡至少2h。将收集的COCs用卵母细胞成熟培养液洗涤2次后移入微滴，每个微滴放15枚20枚COCs，然后转入38.5、100%湿度和5%的CO2的培养箱中培养24h，经透明质酸酶处理脱去卵丘细
11、胞，于体视显微镜下观察，排出第一极体者为成熟卵母细胞。4.2.4 精液收集与准备 在体外受精前30min收集新鲜精液或冷冻精液，精液来源公羊系谱清楚，且鲜精活力0.7以上，冻精解冻后活力0.3。将精子洗涤液（附录A6）与精液按照1:1的比例缓慢加入精液，混匀后1000 rpm5 min离心洗涤2次，然后将精子的密度用精子获能与体外受精液（附录A7）调至4106个/ml6106个/ml。4.2.5 获能与体外受精 DB51/T 30112023 4 将20个30个成熟的卵母细胞移入用50 l精子获能与体外受精液（附录A7）制成的受精液滴中，然后加入2 l调节好密度的精液到每个液滴，在38.5、1
12、00%湿度和5%的CO2的条件下精卵孵育18h22h。4.2.6 早期胚胎培养 将与精子孵育后的卵子（假定的受精卵）在SOF液中洗涤次后，移入预先在培养箱内预先平衡了2h的早期胚胎培养液（附录A8）制成的滴内。将 20枚25枚受精卵分别移入100l 的发育培养液，在38.5、5%CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养4d8d至桑椹胚或囊胚阶段。5 胚胎质量检测 按照NY/T 1674的规定执行。6 胚胎冷冻保存 将质量检测为A级的胚胎进行冷冻保存,低于A级的作为鲜胚进行移植。对于没有胚胎处理实验室的生产场采用慢速降温冷冻保存，对于拥有胚胎处理实验室的生产场和其他机构，采用玻璃化冷冻保存。慢速降温冷
13、冻保存 6.1 6.1.1 药品与器械的准备 0.5mol/L的蔗糖溶液（附录A9）、1.6mol/L的乙二醇冷冻保存液（慢速冷冻保存液）（附录A10）；细管、细管塞、检胚针、装管器、液氮罐、程控降温仪，以及解剖显微镜。6.1.2 装管 将胚胎移入慢速冷冻保存液制成的液滴中，平衡10min后，用0.25ml 细管采用三段或五段装管法（附录B）装管，胚胎装在中间段的冷冻保存液中，两边的液体是0.5mol/L的蔗糖溶液。6.1.3 冷冻 将装有胚胎的细管放入程控降温仪；从室温（20）经10min降温到0，经过15min降到-8；平衡10 min，经过45min从-8缓慢降温到-30；平衡10min
14、，从-30经10min降温到-35；平衡5min后直接投入液氮中保存。玻璃化冷冻保存 6.2 6.2.1 药品与器械的准备 0.5mol/L的蔗糖溶液（附录A9）、10%乙二醇PBS液（附录A11）、EFS30冷冻保存液（附录A12），细管、细管塞、检胚针、装管器、液氮罐，以及解剖显微镜。6.2.2 细管玻璃化冷冻 将胚胎移入10%乙二醇冷冻液平衡5min，然后移入EFS30冷冻保存液中平衡1min后，迅速按照附录B2示意图装管、封口后，迅速直接投入液氮中。DB51/T 30112023 5 包装要求 6.3 将冷冻胚胎装塑料指形管，在塑料指形管上标记供体母羊号、数量、与配公羊号（或冻精号）及
15、生产日期。7 解冻 慢速冷冻保存胚胎的解冻 7.1 将冷冻胚胎细管在空气中停留10s，放入35水浴锅解冻10s，拔去细管塞在解冻后1min5min内完成移植。玻璃化冷冻解冻 7.2 将细管从液氮罐取出，在空气中停留5s；放入30水浴锅中直至蔗糖溶液段由白色变为无色时取出细管用力甩动，使细管中液体充分混合；拔去细管塞，将胚胎在1min5min内完成移植。DB51/T 30112023 6 A A 附录A （资料性）各种液体配制 A.1 PBS 液（磷酸盐缓冲液）8mg/ml NaCl,0.20mg/ml KCl,1.14mg/ml Na2HPO4,0.2mg/ml KH2PO4，配制好后0.22
16、m滤膜过滤4保存。A.2 冲胚液 0.1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+0.025mg/ml卡拉霉素的PBS溶液，配制好后0.22m滤膜过滤4保存。临用时维持在3537。A.3 胚胎操作液 M199*+5mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+5%（v/v）胎牛血清(FBS)+100IU/ml青霉素+100 g/ml 链霉素,然后0.22m滤膜过滤4保存。临用时维持在3537。*M199：通用型商品化的细胞培养液Medium 199。A.4 卵母细胞抽吸液 M199+10%（v/v）FBS+25IU/ml肝素+50g/ml硫酸庆大霉素。A.5 卵母细胞成熟液 M199+0.12 mg
17、/ml丙酮酸钠+10g/ml促卵泡素(FSH)+20g/ml促黄体生成素(LH)+1g/ml雌二醇(E2)+10ng/ml表皮生长因子(EGF)+10%发情山羊血清(EGS)+100IU/ml青霉素+100g/ml链霉素，然后0.22m滤膜过滤4保存。制成培养液滴临用前培养箱中平衡2h。A.6 精子洗涤液（SOF 液）6.30mg/mlNaCl+0.53mg/mlKCl+0.16mg/mlKH2PO4+2.11mg/mlNaHCO3+0.25mg/mlCaCl22H2O+0.1mg/mlMgCl26H2O+0.642ml60%(w/v)的乳酸钠+0.036mg/ml丙酮酸钠+0.27mg/ml
18、葡萄糖+3mg/ml牛血清白蛋白(BSA)+100IU/ml青霉素+100g/ml链霉素，然后0.22m滤膜过滤4保存。A.7 获能与体外受精液 SOF+10%发情山羊血清（EGS）+5g/ml肝素+4g/ml庆大霉素 A.8 早期胚胎培养液 SOF+0.2mM丙酮酸钠+8 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)+20L/mlMEM*+10L/mlBME*+100IU/ml青霉素+100ug/ml链霉素，然后用0.22m滤膜过滤4保存。*商品化培养液：MEM：Minimum Essential Medium液；BME：Basal Medium Eagles液。A.9 0.5mol/L 的蔗糖溶液 将
19、17.15g蔗糖溶解于100ml的PBS液中，4保存，临用前平衡到室温。DB51/T 30112023 7 A.10 1.6mol/L 的乙二醇冷冻保存液（慢速冷冻保存液）A.11 10%乙二醇 PBS 液 按照体积比配制10%的乙二醇PBS液，然后用0.22m滤膜过滤4保存，临用前平衡到室温。A.12 EFS30 液（玻璃化冷冻保存液）首先用0.5mol/L的蔗糖溶液，配制30%（w/v）Ficoll 70000(聚蔗糖)溶液作为FS液，然后在取70ml的FS液中加入30ml乙二醇,制成EFS30液，4保存，临用前平衡到室温。DB51/T 30112023 8 B B 附录B （资料性）胚胎
20、装管示意图 慢速冷冻装管示意图见图B.1。图B.1 慢速冷冻装管示意图 棉线，聚乙烯粉末，0.5mol/L的蔗糖溶液，空气，带胚胎的冷冻保存液，细管塞 玻璃化冷冻装管示意图见图B.2。图 B.2 玻璃化冷冻装管示意图 棉线，聚乙烯粉末，空气（长度0.5cm），带胚胎的EFS30液（长度：0.6cm），EFS30液（长度：0.4cm），0.5mol/L的蔗糖溶液（长度：7.5cm）,细管塞 DB51/T 30112023 9 F C 附录C （资料性）检胚记录表 胚胎记录表见表C.1。表C.1 胚胎记录表 品种：日期：记录人：供体号母羊：公羊：超排情况黄体数：左侧 右侧卵泡数：左侧 右侧其他：鲜胚获卵数质量评定可用胚胎数不可用胚胎数未受精总数等级EMMCMEBBLEXB总数2-8细胞退化ABC合计胚胎冷冻保存情况细管号数量阶段级别小筒号提漏号储存罐号备注冷冻情况方法：冷冻仪型号：手术情况手术冲胚缝合检胚情况检胚冷冻a注：EM：早期桑椹胚；M：桑椹胚；CM：致密桑椹胚；EB：早期囊胚；BL：囊胚；EXB：扩张囊胚
