1、ICS65.202.20CCS B 3145广西壮族自治区地方标准DB45/T 25722022抗（耐）枯萎病香蕉种质鉴选技术规程Technical regulations for identification and screening of bananagermplasm resistant(tolerant)to Fusarium wilt2022-08-25 发布2022-09-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发 布DB45/T 25722022I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由广西壮族自治区农业科学院
2、提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所。本文件主要起草人：周维、黄素梅、韦绍龙、李朝生、韦弟、覃柳燕、韦莉萍、田丹丹、何章飞、龙盛风、黄曲燕、李宝深、李佳林、黄典红。DB45/T 257220221抗（耐）枯萎病香蕉种质鉴选技术规程1范围本文件确定了抗（耐）枯萎病香蕉种质鉴选的程序、界定了香蕉抗枯萎病种质鉴选的术语和定义、规定了苗期鉴选、田间鉴选的操作要求等。本文件适用于广西壮族自治区行政区域内抗(耐)枯萎病香蕉种质的鉴选。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不
3、注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1807香蕉镰刀菌枯萎病诊断及疫情处理规范NY/T 2248热带作物品种资源抗病虫性鉴定技术规程香蕉叶斑病、香蕉枯萎病和香蕉根结线虫病NY/T 5022无公害食品香蕉生产技术规程SN/T 2665香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法DB45/T 1759香蕉二级组培苗生产技术规程3术语和定义NY/T 1807、NY/T 2248及SN/T 2665界定的术语和定义适用于本文件。人工接种鉴定artificial inoculation identification按一定量将收集的病原菌接种到参鉴种质材料，创造发病条件，根据参鉴种质材料的
4、抗性表现和发病程度确定参鉴种质抗性级别的一种方法。自然发病鉴定non-inoculation identification根据参鉴种质在田间自然发病感染诱发程度，确定参鉴种质抗性级别的鉴定方法。苗期鉴选identification and screening in the seedling stage在温室内采用人工接种鉴定的方法，将参鉴种质无病二级组培苗伤根后移栽至含规定病原菌孢子浓度的基质中，28 条件下种植一定时间后，调查各个参鉴种质发病情况，经结果分析确定各个香蕉参鉴种质的抗性水平，选出符合田间鉴选的高抗种质要求的一种方法。田间鉴选identification and screenin
5、g in the field在枯萎病病区选择试验地种植经苗期鉴选的抗性种质，调查各个参鉴种质在不同生长时期发病程度，经结果分析确定各个香蕉种质的抗性水平,选出对枯萎病具有抗性植株的一种方法。DB45/T 257220222病情指数校正系数(K1)sickness index correction factor（K1）经过理论推算与实际结果验证相结合，确定一个合理数值，使用该数值与对照品种的病情指数相除所得的比值。发病率校正系数(K2)incidence correction factor（K2）经过理论推算与实际结果验证相结合，确定一个合理数值，使用该数值与对照品种的发病率相除所得的比值。相对
6、病情指数relative disease index（RDI）参鉴种质的实际病情指数与病情指数校正系数的乘积。相对发病率relative incidence rate（RIR）参鉴种质的实际发病率与发病率校正系数的乘积。4技术流程抗（耐）枯萎病香蕉种质鉴选技术流程如图1所示。苗期鉴选苗期抗病性评价苗期抗（耐）病种质筛选田间鉴选田间抗病性评价田间抗（耐）病种质筛选参鉴种质图 1抗（耐）枯萎病香蕉种质鉴选技术流程5苗期鉴选参鉴品种（系）的要求参鉴种质以68叶的无病二级香蕉组培苗为宜，二级组培苗的划分按DB45/T 1759的规定执行。病原菌的分离、培养及致病性鉴定按SN/T 2665的规定执行。病
7、原菌培养基质制备将椰糠、玉米粉和水按质量比2:10:7的比例混合均匀，分装在玻璃瓶中，高温高压灭菌（121，20 min）二次。无菌条件下，将在PDA培养基上培养1周的Foc4菌饼（直径0.8 cm1.0 cm）接种于高压灭菌二次后的基质中，28，暗培养21d。将培养Foc4的基质碾碎混匀，取10 g基质加90 mL无菌水稀释，结合梯度稀释法，显微镜下用血球计数板计数，并计算出基质中Foc4分生孢子浓度。DB45/T 257220223鉴选基质制备根据5.3所得病原基质接种体的Foc4孢子浓度，将病原基质接种体与未种植过植物的新椰糠按照一定比例混匀，使病原基质中Foc4分生孢子浓度达105个/
8、g106个/g，用于香蕉苗期种质鉴选。试验设计参鉴种质、对照品种的小区处理采用完全随机区组设计，4次重复，每小区种植株数1030株。每10份参鉴种质设1份已知感病品种作为对照，参鉴种质少于10份时设1份已知感病品种作为对照，对照品种宜采用高感品种巴西蕉或威廉斯。接种方法苗期抗性鉴定宜通过伤根法进行人工接种。将56叶参鉴香蕉种质的无病二级组培苗取出，用剪刀将组培苗23条根，距离根尖0.5 cm处剪伤后，种植到按5.4要求制作的鉴选基质中，正常水肥管理。调查及计算方法5.7.1接种 30 d 后观察并调查植株外观发病情况，第 40 d 调查每株香蕉苗的外部及内部枯萎病症状。按照表 B.1 及图 B
9、.1 的标准调查植株内部及外部症状的病害级别，按照表 C.1 的格式记录。5.7.2根据调查统计结果，按式（1）计算种质材料的病情指数（DI），按式（2）（3）计算校正指数及相对病情指数，所得结果保留小数点后一位。=100(1)式中：DI病情指数；Rn各级病株数；Kn相对级数值；N 调查总株数；K 最高级数值。1=50(2)式中：50 相对系数；K1 病情指数校正系数；DIC感病对照品种病情指数。=1 (3)式中：RDI相对病情指数；DIT参鉴种质病情指数。抗病性评价根据参鉴种质平均相对病情指数，按照表1分别评价苗期对枯萎病的抗性水平。所得结果按表C.2的格式填写。DB45/T 2572202
10、24表 1香蕉种质苗期枯萎病抗性评价标准抗性级别免疫(I)高抗（HR）抗（R）中抗(MR)感(S)高感(HS)平均相对病情指数00RDI1010RDI2020RDI3030RDI4040抗（耐）病种质筛选根据抗性评价结果，从参鉴种质中选择其中12个抗性水平高的种质，选取100株以上二级组培苗，伤根接种于Foc4孢子浓度为106个/g病原基质中，从植株外观判断发病情况，发病率为5080时，选取外观未见发病症状的植株，将植株根部冲洗干净后，从球茎底端1/5处横切，观察球茎褐变面积，选取球茎无褐变或有浅色褐变且面积小于剖面面积5的植株，重新种植于无Foc4的育苗基质中，作为抗（耐）枯萎病种质材料供进
11、一步研发。6田间鉴选鉴选圃地6.1.1鉴选圃地的选择选择前作香蕉枯萎病发病率在70以上，土壤肥力一致，发病均匀且未经轮作其他作物的旧蕉园；整地时用机耕混匀土壤，混匀后土壤中Foc4孢子浓度不低于103个/g。土壤中Foc4孢子浓度的检测按附录D执行。6.1.2灌溉条件及空气质量按NY/T 5022的规定执行。参鉴种质的要求按5.1规定执行。田间设计参鉴种质、对照品种的小区处理采用完全随机区组设计，4次重复，每小区种植株数2040株，对照品种可采用高感品种巴西蕉或威廉斯。采用自然发病鉴定，鉴选圃地四周设保护行。田间管理按NY/T 5022的规定执行。参鉴品种及对照品种全生育期不使用对枯萎病菌有直
12、接抑制作用的技术措施。调查及计算方法6.5.1病情调查及发病率计算方法按 NY/T 2248 的规定执行。6.5.2校正系数及相对发病率按式(4)、(5)计算。2=80%(1)式中：K2发病率校正系数；DB45/T 25722022580相对系数；IC感病对照品种发病率。=2 (2)式中：RIR相对发病率；IT 待测品种（系）发病率。抗病性评价根据参鉴种质平均相对发病率，按照表2分别评价田间对枯萎病的抗性水平。所得结果按表C.3的格式填写。表 2香蕉种质田间枯萎病抗性评价标准抗性级别免疫(I)高抗（HR）抗（R）中抗(MR)感(S)高感(HS)平均相对发病率00RIR1010RIR2020RI
13、R4040RIR6060抗（耐）病种质筛选6.7.1根据苗期抗性评价结果，从参鉴品种中选择抗性级别为中抗及以上级别的参鉴品种（系），按4.9 方法筛选得到的抗（耐）种质，选取经无病基质种植 1 个月以上恢复生长的植株，种植到鉴选圃地中，逐月观察植株的发病情况，对出现典型的黄叶、茎部纵裂等外部症状的植株进行球茎横切，观察判断是否为发病植株，判断方法按 NY/T 1807 的规定执行。6.7.2挖出已确定的发病植株并淘汰处理，持续观察未病参鉴植株，直至全生育期收获，筛选留存未病或极轻病植株（发病最严重症状为：黄叶数/总叶数10），挖其吸芽观察判断，若内外部均未见枯萎病症状，则取其吸芽进行再繁殖，作
14、为抗（耐）枯萎病种质材料供进一步研发。DB45/T 257220226AA附录A（资料性）香蕉枯萎病的病原及症状A.1病原菌香蕉枯萎病主要由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,race4，Foc4)引起。A.2香蕉枯萎病主要症状香蕉植株发病后，外部病症主要表现为：叶片由下部向上部逐渐变黄、萎蔫、叶鞘向外折曲，叶片下垂、新叶抽出迟缓或不能抽出、畸形；严重者，整株叶片枯死倒挂。假茎近地面处出现纵裂。内部症状主要表现为：横切或纵切球茎可见内部变褐色、深褐色、棕红色、深红色、黑棕色等，病害严重的植株，整个球茎内部明显地变为深红色及黑褐色，中
15、柱和内层的叶鞘变褐色；横切发病植株假茎可见维管束有红棕色或紫红色斑点，并从假茎基部逐渐向上延伸。病茎旁所生吸芽的导管也会受侵染，纵剖球茎，可以看到红棕色的维管束从母株延伸侵染的迹象。DB45/T 257220227BB附录B（规范性）病害分级图表病害分级见表B.1及图B.1。表 B.1 香蕉苗期枯萎病发病程度分级表病害级别香蕉苗期病害症状内部症状外部症状0球茎切面未变色叶片未变黄，假茎组织未见变褐1球茎切面变淡黄或浅黄色，无褐色或深褐色病变组织老叶轻微黄化或不黄，假茎组织未见变褐3球茎切面变黄色或褐色，球茎变褐色或深褐色面积小于20老叶黄化，假茎组织未见变褐5球茎切面变色面积大于 50，球茎褐
16、色或深褐色面积2150老叶黄化、嫩叶部分有黄化，新叶抽出困难，假茎上部正常无褐变，下部有浅褐色斑点或条状病变7球茎切面变色面积大于 75，球茎变深褐色或紫红色或黑色面积 51以上叶片全部黄化，假茎上、下部均有褐色条状病变9植株濒死或死亡球茎及假茎下部腐烂、植株濒死或死亡注：分级时主要以球茎的褐变程度进行判断，并辅以外部叶片变黄情况进行判断，各重复级别不一致时，以抗性差者的级别作为该品种（系）的抗性级别。图 B.1 香蕉苗期枯萎病内部症状分级图DB45/T 257220228CC附录C（规范性）抗性评价记录表抗性评价及调查结果记录见表C.1表C.3。表 C.1香蕉种质对枯萎病苗期抗性评价调查表（
17、人工接种鉴定）株号重复1重复2重复3外部症状级别内部症状级别外部症状级别内部症状级别外部症状级别内部症状级别12345678910表 C.2_香蕉种质对枯萎病苗期抗性评价表（人工接种鉴定）参鉴品种病情指数重复1重复2重复3相对病情指数重复1重复2重复3平均相对病情指数抗性评价DB45/T 257220229表 C.3香蕉种质对枯萎病田间抗性评价表参鉴品种发病率（）重复1重复2重复3相对抗性效果重复1重复2重复3平均相对抗性效果抗性评价DB45/T 2572202210DD附录D（规范性）土壤中尖孢镰刀菌古巴专化型 4 号生理小种（Foc4）孢子浓度检测方法D.1平板计数法采用五点取样法，对栽种
18、香蕉土壤采用随机取样法，或采取发病植株下土样。样本采集过后置于阴凉处自然风干，过20目筛。每个样本取0.1g干重，溶于100ml无菌水中，悬浮震荡混匀，经灭菌纱布过滤后梯度稀释制备10-3 g/ml、10-4 g/ml、10-5 g/ml、10-6 g/ml 孢子悬浮液。涂布于Komada选择性培养基上，依据选择性培养平板计数，确定孢子浓度。DB45/T 2572202211参考文献1黄素梅,韦绍龙,韦莉萍,李朝生,覃柳燕,韦弟,田丹丹,龙盛风,何章飞,周维.8种香蕉种质对枯萎病的抗性比较与分析J.热带作物学报,2019,40(11):2189-2196.2刘勇,秦西云,李文正,陈学军,马文峰
19、,文辉,龚伟,张第喜,王炳豪.抗青枯病烟草种质资源在云南省的评价J.植物遗传资源学报,2010,11(1):10-16.3吴征彬.棉花枯黄萎病及其抗性鉴定技术J.植物遗传资源科学,2000,1(4):47-51.4黄永辉,陈琦光,迟远丽,杨媚,周而勋.土壤理化因素对香蕉枯萎病菌生长和侵染的影响J.华中农业大学学报,2016,35(02):30-34.5李敏慧,习平根,姜子德,等.广东香蕉枯萎病菌生理小种的鉴定J.华南农业大学学报,2007,28(002):38-41.6舒灿伟,张源明,曾蕊,周而勋.香蕉枯萎病菌4个生理小种生化特征的比较J.华中农业大学学报,2017,36(03):32-37.
20、7Li Xingshen,Bai Tingting,Li Yunfeng,et al.Proteomic analysis of Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4-inoculated response to Fusarium wilts in the banana root cells.J.Proteome Science,2013,11(1):41.8Peng H X,Sivasithamparam K,Turner D W.Chlamydospore germination and Fusarium wilt ofbanana plantlets in suppressive and conductive soils are affected by physical and chemical factorsJ.SoilBiology&Biochemistry,1999,31(10):1363-1374.
