1、 ICS 65.020.30 CCS B44 43 湖南省地方标准 DB 43/T 28162023 鱼类粘孢子虫检测方法 Detection methods of fish myxosporean 2023-11-09 发布 2024-02-09 实施湖南省市场监督管理局发 布 DB 43/T 28162023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂与材料.1 5 仪器与设备.1 6 采样.2 7 检查步骤.2 8 结果判定.3 附录 A（规范性）试剂及其配制.4 附录 B（资料性）不同粘孢子虫感染症状及包囊形态.5 附录 C（资料性）几种常
2、见粘孢子虫成熟孢子形态.6 DB 43/T 28162023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南农业大学、湖南应用技术学院、资兴市水产良种场、中国科学院水生生物研究所。本文件主要起草人：刘新华、任诗思、皮杰、李德亮、向建国、余建波、吕欣荣、刘志辉、叶少文。DB 43/T 28162023 1 鱼类粘孢子虫检测方法 1 范围 本文件给出了鱼类粘孢子虫检测
3、的试剂与材料、仪器和设备、采样、检查步骤与结果判定方法。本文件适用于鱼类粘孢子虫的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7223.1 黏孢子虫病诊断规程 第 1 部分：洪湖碘泡虫 SC/T 7223.2 黏孢子虫病诊断规程 第 2 部分：吴李碘泡虫 SC/T 7223.3 黏孢子虫病诊断规程 第 3 部分：武汉单极虫 SC/T 7223.4 黏孢子虫病诊断规程 第
4、4 部分：吉陶单极虫 SN/T 2503 淡水鱼中寄生虫检疫技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 试剂与材料 本标准所使用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水。乙醇：70%乙醇。溴酚蓝。10 xPCR Buffer MIX：-20保存，避免反复冻融。引物序列 上游引物 MyxospecF：5-GAT TGA CGA GGT CGT TCG TTT A-3；下游引物 MyxospecR：5-AGT AGG CCC TTA CCC TAC TTA C-3；本对引物扩增小核糖体小亚基 rRNA 基因（18S rDNA）的部分序列。DNA marker 2000（bp）:2000、10
5、00、750、500、250、100。5 仪器与设备 解剖盘、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀。体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。盖玻片、载玻片、培养皿、巴氏吸管。恒温水浴锅（控温范围：RT-1001）。DB 43/T 28162023 2-20和-80冰箱。微量移液器（0.5 L10 L，10 L100 L，100 L1000 L）。PCR 扩增仪。离心管和 PCR 管。高压灭菌锅。超净工作台。水平电泳系统。紫外透射仪或凝胶成像系统。6 采样 样品的采集应符合 SC/T 7103、SC/T 7223.1、SC/T 7223.2、SC/T 7223.3 和 SC/T 7223.4 中的相关要求，样
6、品封存和运输应符合 SC/T 7103 的相关规定。7 检查步骤 目检 观察样品，检查顺序应符合 SN/T 2503 中的相关要求，先检查体表部位是否有明显的白色包囊或似包囊状的瘤状物，如体表皮肤、鳍、鼻腔、口腔、眼球等，随后解剖鱼体观察内脏是否出现白色包囊，包括体腔、脂肪组织、胃肠、肝、脾等。镜检 7.2.1 当在 7.1 中发现疑似包囊状物时，用剪刀与镊子将单个或多个包囊分离，置于载玻片上。然后，再用解剖针戳破疑似包囊物，加入约 10 L 双蒸水，盖上盖玻片置于光学显微镜中检查是否存在成熟孢子。7.2.2 当在 7.1 中未发现疑似包囊状物时，用剪刀或镊子取少量组织或液体（胆汁、血液、尿液
7、等）置于载玻片上，用镊子将组织分散，加入约 10 L 双蒸水，盖上盖玻片，稍加压平，置于光学显微镜中检查是否存在成熟孢子。分子鉴定 7.3.1 检测样本固定 将 7.2 中粘孢子虫感染的包囊或组织从宿主上分离，用 70%的乙醇固定于离心管中（参见附录 A），低温（-20）保存，标识好标签并记录。7.3.2 DNA 提取 将 7.2 固定的样品充分混匀，破碎后用磷酸盐缓冲液洗涤两次以去除残余酒精。将离心管置于-80冰箱快速冷冻 5 min，取出并立即置于 80水浴锅中 5 min，重复三次后镜检观察孢子是否完全破碎，极丝是否挤出。破碎后利用细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒，提取样品基因组 D
8、NA。提取好的基因组DNA 置于-20保存备用。7.3.3 PCR 扩增 DB 43/T 28162023 3 在 50 L 的 PCR 反应体系中，包含模板基因组 DNA 2 L、10PCR Buffer MIX（康为世纪）25L、上游引物和下游引物（10 M/L）各 2 L、加双蒸水定容至 50 L。在 PCR 扩增仪中，反应程序为 94预变性 4 min；94变性 1 min；46退火 50s；65延伸 1 min,35 个循环；65终延伸 10 min。PCR 扩增时，应设置阴性对照和阳性对照。7.3.4 PCR 产物电泳与测序 取 5 微升 PCR 扩增产物，用添加溴酚蓝指示剂的 1
9、.0%琼脂糖凝胶于 TAE 缓冲液（参见附录 A）中电泳分离，同时设置 DNA 分子量标准作参照，紫外透射仪下检查是否存在大约 900 bp 的目的条带。如果存在，则取 PCR 扩增产物测序，测序后通过 GenBank 进行 BLAST 比对。8 结果判定 目检 当肉眼观察到明显白色包囊或疑似白色囊状物（见附录 B），可以怀疑为粘孢子虫感染，但需经 8.2、8.3 步骤检查后才能进一步确诊。镜检 8.2.1 将经 8.1 步骤检查未观察到明显包囊的组织进一步置于解剖镜下，观察是否有肉眼不可见的白色包囊（见附录 B），如观察到需将其从组织中分离，并经 7.2.2 进行观察后确诊。8.2.2 将经
10、 8.1 和 8.2.1 步骤观察的疑似包囊以及外观正常的少量组织进行压片，观察到明显的粘孢子虫成熟孢子即可确诊（见附录 C）。分子鉴定 将所测定的 18S rDNA 序列（900 bp 左右）与 GenBank 数据库中粘孢子虫序列进行比对，如比对出来的种类均为粘孢子虫序列相似性在 80%以上，即可判定为粘孢子虫。DB 43/T 28162023 4 A A 附录A （规范性）试剂及其配制 A.1 70%乙醇溶液 70 mL 无水乙醇溶液，加 30mL PBS 缓冲液（0.01 mol/L,pH7.4）。A.2 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L,pH7.4）称 7.9g NaCl，0.2g
11、 KCl，0.24g KH2PO4（or 1.44g Na2HPO4）和 1.8g K2HPO4，溶于 800 ml 蒸馏水中，用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4，最后加双蒸水定容至 1 L，4冰箱保存。A.3 TAE 电泳缓冲液（50 倍）称量 242.0 g Tris 碱、37.2 g Na2EDTA2H2O 混合，然后加入 800 mL 的去离子水充分搅拌溶解，再加入 57.1ml 的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至 1L，室温保存。A.4 溴酚蓝指示剂溶液 取溴酚蓝 100 mg，加双蒸水 5 mL,在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，
12、摇匀后加双蒸水定容至 50 mL，加入氢氧化钠（NaOH）溶液 1 滴，调至蓝色。DB 43/T 28162023 5 B B 附录B （资料性）不同粘孢子虫感染症状及包囊形态 图B.1 不同粘孢子虫病感染症状(A)：普洛宁碘泡虫感染鲫鱼腹腔症状，靶尺=1 cm；(B)：吉陶单极虫感染散鳞镜鲤皮肤症状，靶尺=5 cm；(C)：米氏碘泡虫感染鲶肠道症状，靶尺=5 cm；(D)：九州碘泡虫感染鳙鱼皮肤，靶尺=5 mm；(E)：汪氏单极虫感染异育银鲫鳃症状，靶尺=0.5 cm；(F)：鳃基碘泡虫感染拟鲤鳃基部症状，靶尺=500 m。DB 43/T 28162023 6 C C 附录C （资料性）几种常见粘孢子虫成熟孢子形态 图C.1 不同粘孢子虫孢子形态(A)：巨间碘泡虫，靶尺=20 m；(B)：帕夫洛斯碘泡虫，靶尺=20 m；(C)：多涅茨尾孢虫，靶尺=10 m；(D)：武汉单极虫，靶尺=5 m。
