1、 ICS 67.080.20 CCS B31 43 湖南省地方标准 DB 43/T 28122023 普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR 法）技术规程 Code of practice for purity identification of sponge gourd hybrid(SSR method)2023-11-09 发布 2024-02-09 实施湖南省市场监督管理局发 布 DB 43/T 28122023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 原理.1 4 主要仪器设备、试剂耗材.1 5 试剂配制.2 6 引物.2 7 鉴定流程.2 8 纯度计算.3 附录 A
2、（资料性）常用试剂配方.5 附录 B（资料性）引物信息.7 DB 43/T 28122023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件主要起草单位：湖南省蔬菜研究所、长沙市农业科学研究院、长沙县农业局、岳阳市农业科学研究院，湖南湘妹子农业科技有限公司。本文件起草人：韩小霞、胡新军、闵子扬、李勇奇、邓稳桥、卢亚楠、刘昆言、粟建文。DB 43/T 28122023 1 普通丝瓜杂交
3、种纯度鉴定（SSR 法）技术规程 1 范围 本文件规定了丝瓜杂交种纯度鉴定的主要仪器设备、试剂耗材、试剂配制、引物、鉴定流程和纯度计算。本文件适用于普通丝瓜杂交种纯度鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 3 原理 SSR标记技术是一种以特异引物PCR扩增为基础的分子标记技术。由于SSR标记广泛存在于植物基因组上，不同材料每个位点重复单位的数量及序列可能不同，故而形成扩增片段的
4、长度多态性。根据扩增片段电泳谱带的差异，可鉴定杂交种纯度。4 主要仪器设备、试剂耗材 主要仪器设备 研钵、镊子、电子天平（精度值为0.001）、高速台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、高压灭菌锅、通风柜、胶片观察灯、数码相机、4 冰箱和-20 冰箱。主要试剂 乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、三羟甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane
5、，Tris）】、三氯甲烷(Chloroform)、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）、乙醇（Ethanol）、异丙醇（Isopropanol）、异戊醇（Isoamyl alcohol）、Taq DNA聚合酶、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（N，N，-methyleme bisacrylamide）、四甲基乙二胺（TEMED）、硼酸（Boric acid）、过硫酸铵（Ammonium persulfate）、硝酸银（Silver nitrate）、冰醋酸（Glacial aceti
6、c acid）、醋酸钠（Sodium acetate）、甲醛（Formaldehyde）、水（H2O）符合GB-T 6682-2016规定。主要耗材 离心管（0.6 ml、1.5 ml、2.0 ml）、枪头（白枪头、黄枪头、蓝枪头）、枪头盒、48孔板、96孔PCR扩增板、96孔PCR扩增板管盖、量筒、发芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。DB 43/T 28122023 2 5 试剂配制 相关试剂配制方法见附录A 6 引物 部分SSR引物信息见附录B 7 鉴定流程 种子催芽 种子扦样参考GB/T 3543.2。取丝瓜杂交种约250粒，父母本约各10粒，温汤浸种后，2830催芽至种子露
7、出子叶。取样 取发芽种子胚轴0.5 cm1 cm，用于DNA提取.DNA 提取方法 可采用CTAB小样法或者快速碱煮法提取。7.3.1 CTAB 小样法 将丝瓜样品放于研钵中，加入0.8 mL DNA缓冲液，研磨均匀，将磨好的样品倒回至2 ml离心管，冰上放置或者放冰箱冷冻。将研磨好的样品放置于48孔板架上，60 水浴30 min，中间每隔5 min摇一次，使样品受热均匀。取出管架，打开2 mL 离心管管盖，然后加入0.8 mL氯仿:异戊醇（24:1）溶液，颠倒混匀。室温下静置5 cm10 min后10,000 rpm离心5 min；将上清仔细移至另一2 mL离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，
8、室温静置3 min，5,000 rpm离心5 min，去除上清。用70%的乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇全部风干后，加入500 L 60 预热的ddH2O，再加入5 L RNaseA(10 g/l)，37 温浴10 min，最后加入1/10体积的3 mol/L NaAc及2体积的冰乙醇，混匀，-20 放置20 min。5,000 rpm离心5 min，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，风干乙醇后加入200 L ddH2O。用紫外分光光度计检测DNA浓度并将DNA溶液用ddH2O稀释到20 ng/L，-20 冰箱中保存备用。7.3.2 快速碱煮法 将丝瓜胚轴放入96孔PCR板管底部，并加入0.25
9、mol/L的NaOH溶液50 L，用96孔板盖盖好PCR板，置于沸水中煮3 min，最后加入0.1 mol/L的TrisHCl(pH=8.0)150 L。PCR 扩增 7.4.1 扩增体系 DNA模板约 0.5 L，10Buffer 1 L，10 mmol/l dNTP 0.1 L，10 pmol/l SSR引物0.2 L，2.5 U/l rTaq 0.1 L，加灭菌ddH2O至总体积10 L。7.4.2 反应程序 DB 43/T 28122023 3 94 预变性4 min，94 变性30 s，58 退火30 s，72 延伸30 s，共30个循环，最后72 延伸5 min，4保存。电泳检测
10、PCR结束后，在每孔中加入2 L 6加样缓冲液，混匀，置于4 冰箱待检测。对于扩增条带大小差别不大的扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带大小差别较大的扩增产物宜采用普通琼脂糖凝胶电泳。7.5.1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 7.5.1.1 电泳装置准备 将玻璃板清洗干净，盖上凹槽玻璃板。利用琼脂糖凝胶封好玻璃板。将封胶好的玻璃板放在电泳槽中，将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪连接。7.5.1.2 灌胶 将现配的8%丙烯酰胺（PAGE）凝胶，轻轻摇匀，缓缓灌入玻璃胶室，胶灌满整个胶室后，插入样品梳，室温下聚合90 min。胶完全聚合后，加入0.5TBE电泳缓冲液，拔出样品梳。7.5.1.3 点
11、样与电泳检测 每个PCR扩增产物中加2 L 6加样缓冲液，充分混匀后，每个加样孔加入3 L样品，并设置标准分子量DNA作片段大小标准。180 V恒压电泳90 min左右。7.5.1.4 染色、显色和拍照 电泳结束后，将凝胶放在专用盆中，加入500 ml蒸馏水清洗2遍3遍后，放入染色液中，染色3 min5 min，取出胶板，用蒸馏水漂洗2次3次。将胶板放入盛有400 mL显影液的托盘中，轻轻摇动至条带清晰后，迅速用蒸馏水漂洗3遍5遍，将胶用保鲜膜包好，置于胶片观察灯上，观察带型并拍照记录。7.5.2 普通琼脂糖凝胶电泳 将PCR产物与2 L 6加样缓冲液混合，点样至1.0%3.0%的琼脂糖凝胶点
12、样孔内（含有0.5 g/ml的溴化乙锭或者其它指示剂），同时设置标准分子量DNA作片段大小标准，在1TAE缓冲液中进行凝胶电泳，电泳电压120 V，电泳时间约30 min，并在凝胶成像系统控制软件上观察记录PCR扩增条带。8 纯度计算 SSR扩增条带表现双亲带型，则为杂交种；表现任一亲本带型或者其他带型，则为假杂种。分别统计杂交种和假杂种的样品数量，根据式(1)计算杂交种纯度。=121 100%(1)式中：代表杂交种纯度 1代表检测总数 2代表非杂交种谱带类型的个体数量 DB 43/T 28122023 4 DB 43/T 28122023 5 A A 附录A （资料性）常用试剂配方 A.1
13、DNA 提取试剂 A.1.1 0.5 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）（pH 8.0）溶液 称EDTA 186.1 g，加入已有800 ml双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH值至8.0，补双蒸水至1000 ml，用玻璃棒搅拌、摇匀，分装至100 ml的玻璃瓶中，高压蒸汽灭菌（121，20 min）后，置于4 冰箱中保存备用。A.1.2 1 mol/L Tris-HCl（三羟基氨基甲烷盐酸，pH 8.0）溶液 称121.1 g Tris加入含有800 ml双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至8.0，补双蒸水定容至1 L，摇匀，4 冰箱中保存备用。A.1.3 DNA 提取液 取1 mol/
14、L Tris-HCl溶液50 ml、0.5 mol/L EDTA溶液20 ml，称SDS 7.5 g和氯化钠14.6 g加入到500 ml烧杯中，用双蒸水定容至500 ml，充分混匀，使得溶液中的最终浓度为TrisHCl 100 mmol/L，EDTA 20 mMol/L，NaCl 500 mmol/L，SDS 1.5%（v/v）。A.1.4 氯仿:异戊醇:乙醇（80:4:16）取160 ml三氯甲烷，8 ml异戊醇和32 ml乙醇加在一起混匀，4 冰箱保存备用。A.1.5 0.25 mol/L的 NaOH 称取NaOH 1g，加入双蒸水定容至100 ml。A.1.6 0.1 mol/L的Tr
15、isHCl 取1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 ml，加双蒸水定容至100 ml。A.2 PCR 扩增试剂 PCR扩增所用的dNTP，Taq DNA聚合酶均从试剂公司（北京全式金生物技术有限公司）购买，-20 保存备用。引物委托上海生工生物工程公司合成，并将合成后的正向和反向引物用灭菌的双蒸水配置成100 M的储存液，从中取10 l加90 l双蒸水配置成10 M的工作液，-20 保存备用。A.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 A.3.1 10TBE 缓冲液 称取108 g Tris，55 g硼酸，40 ml 0.5 M EDTA(pH 8.0)，加入烧杯中，用双蒸水定容到1
16、L，摇匀。A.3.2 10%（W/V）过硫酸铵溶液（APS）称0.1 g过硫酸铵，加入1 ml双蒸水，混匀，现配现用（保质期48 h）。DB 43/T 28122023 6 A.3.3 1TBE 缓冲液 取10TBE 缓冲液200 ml，加双蒸水1800 ml，摇匀。A.3.4 1TAE 缓冲液 取10TAE 缓冲液200 ml，加双蒸水1800 ml，摇匀。A.3.5 6加样缓冲液 称取溴酚蓝0.25 g，二甲苯青0.25 g，加98 ml甲酰胺溶液和2 ml EDTA（pH 8.0）溶液溶解，混匀，-20 保存备用。A.3.6 8%PAGE（丙烯酰胺）凝胶 40%PAGE 8 ml、10T
17、BE 4 ml、ddH20 28 ml、10%AP 400 l、TEMED 20 l，总体积40 ml，实践中可根据垂直板的大小按比例配置凝胶。A.4 银染、显影试剂 A.4.1 染色液 称1.5 g硝酸银，加双蒸水1000 ml溶解，再加1.5 ml甲醛混匀。A.4.2 显影液 称15 g氢氧化钠，加入1000 ml双蒸水溶解，再加7.5 ml甲醛，混匀。DB 43/T 28122023 7 B B 附录B （资料性）引物信息 表B.1给出了部分引物信息，更多引物设计请参考国际葫芦科基因组网站（http:/www.icugi.org）公布的信息。表B.1 部分 SSR 引物信息 引物编号 5
18、-3正向引物序列 3-5正向引物序列 S01 CTCCCTCTTTCCCTCACTCC GACAGGACCGTTAACCCAAA S02 TAAATACCCGCCTCGAACAC TCCATCCCAGATTTTGCTTC S03 GGGAGAACAAGATAGCCCAA TGCAAACTTCGATTTGCTCA S04 CAGCTCTACAACAACATCTC ATCATTGGATGTGGGATTCTC S05 AAGATTGAAGTGGGAAAATG CGGCAATCATCTTATCTTTC S06 TGGAGTGTTGACATTGTTTTCA GGTTGGAGTAAGCCAAATTACA
19、S07 TTGAAGATGAAGCCGGAGTT CTAGAGTCAGATGCCTCGCC S08 AGAATAAGGTCCACATAAGG GTTAAAGGCTATGGTATAGAAC S09 CAGCTCTACAACAACATCTC ATCCAACTCGACCAAGAAAC S10 ACTCAATCCAACCCACGAATAG TGGCATTTGAACGCTAAGTTG S11 TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTT ATGTCGTACCTTTTCCCCTTTT S12 TTTGAATCTCGCCATGAAG CTACCCTGTTTTGCAGCTACG S13 CTCCTCAAGAA
20、AATCCACTTCC CCAGGTAATTCTCCTCCATGTC S14 TATTGCCCCAAACTCTTCTCTC ATGGACAAAACTTCATAACGCC S15 TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTT ATGTCGTACCTTTTCCCCTTTT S16 TTCCCCATCCATACATTTCTTC CCCTCTCTTCTCCATTTTCTCA S17 GGCGGAATACAAGAAAGATACC CATGTGAAAAGGGAACAGAGAA S18 CCAACTATCACCCCTACAATCA GGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGAG S19 GTCTTCCT
21、GAGAGCTTTTGCAT CCCTCTTCTCCTTCGATCTTCT S20 AACCTCTCGTCATTACTACCGC GTGACTAAAAGCGTGTGAGTGG S21 CGTTTGAGATGTGTGCATGTAG TTAAGAGACTGGTTGGAGTTGAGA S22 TACCTTCACCCAACTCGCTATT GTGTGTGTTTGATCGGCTGTT S23 TTTGTTCTATTCCCCTCTTCCA TCGATTACGACGACTTTCTTGA S24 TCAGGAAGTGGAGACAACACC GGGAAAAGACTGCACCATCA S25 GCTCTCGATT
22、CTAACCAAAACC TCATTCTACCTCTCCAATTCCA S26 ACATTTTCACTAGCAGAAGGGG GTGCCCATGTATAGGAAGCAA S27 GAAAGAAGGCGAGGAGTGTAGA GAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTT S28 TTTGGGCTCTGACATTAGATGA ACACCTTTGGGAGATAACAAGC S29 CTCCAAGGAAGAAGAAGAAACC AATACTGCCACATCATCAGCTC S30 GGAGGAGGGAAGAGGAGATG AGGTAAAGCAACAACCCCATAA S31 GTCGCCACCGTTG
23、AGTTT AACCTTAATCCGGCTAGGAAAG DB 43/T 28122023 8 表B.1 部分 SSR 引物信息（续）引物编号 5-3正向引物序列 3-5正向引物序列 S32 CATCACCACCACCACAACC GCCACCAAAATCAGCTCTATG S33 AGAAGTGGGAGATTGAACATGC GTTGGTATGTGAACCTTGAGGC S34 TCCACCAACTCTCACTTTCCTT GCATATCCCCAAAACGAACTAA S35 AAGACAAATTAAGGAGGGGAGG TAAGACGAGCGTAATGGTTGAC S36 TTCTTTCT
24、CCTTCGCTGTCTTC GGGATGATGATATTCGGAGCTA S37 CCACCCCATTTCATACACAATA CATTCAACCTAAGAGCGAGTGA S38 AATTTTATGGACCTCATTCCCC TTTACCAAACCCAATTCTAGCC S39 GTTTGTTGGAATTAGGGTGGAG CTTTGGGAGGAGATTGATTTTG S40 TACCGATGCTCTGTTCTTGCTA TTCCCACTTCATTGTCCAAAGT S41 TGAGAGAGAAACATTGGGACCT ATGAGAGATTTGACTTGGGGAA S42 TGGCTAAT
25、TGGGTGAGCTACAG TGGTGGAAGTGTTACTGTGTGTG S43 CTAGCCACCTCTGATATGCAAC GTCCTACCCCTTATGACTATTTTGT S44 AACATGGGATAAAACGGACATC AGTTGCCGCTGTTTGAGTAAGT S45 AACAAACGCATAGGAGAAGAGC TCAGGGGAAACTGATTTATTGC S46 CAATCTCAAACCCAAGTTCCAG AACAGAATGGTGAGGCAGATG S47 ACTATAAGAACGTGCAGGCCAT GAAGAAAGCTAATGTTGGTCGG S48 GGGCTTCACCACACATTTCT GAACAAGGGAAGATTTAGGTCAAC S49 TATAATGGTCCCACTGAAAGCC CATTCCAGCACCTACAGCTTC S50 TATAATGGTCCCACTGAAAGCC CATTCCAGCACCTACAGCTTC
