1、 ICS 07.080 CCS B47 43 湖南省地方标准 DB 43/T 25872023 蚕砂中氯霉素残留量的测定 液相色谱串联质谱法 Determination of chloramphenicol residues in silkworm excrementliquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2023-04-10 发布 2023-07-10 实施湖南省市场监督管理局发 布 DB 43/T 25872023 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法提要.1 5 试剂
2、与材料.1 6 仪器与设备.2 7 试样的制备与保存.2 8 分析测定.2 9 结果计算.4 10 测定方法的线性范围、灵敏度、准确度、精密度.5 附录 A（资料性）氯霉素及其同位素内标的液相色谱-串联质谱图.6 DB 43/T 25872023 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件主要起草单位：长沙海关技术中心。本文件主要起草人：焦艳娜、梁香、齐鹤鸣、朱绍华、尹雪花、彭争光
3、、唐会智、肖中宁。DB 43/T 25872023 1 蚕砂中氯霉素残留量的测定 液相色谱串联质谱法 1 范围 本文件规定了蚕砂中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于蚕砂中氯霉素残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法提要 蚕砂中氯霉素用乙酸乙酯提取，GCB和C18固相萃取柱净化，液相色谱-串联质
4、谱仪测定，内标法定量。5 试剂与材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。试剂 5.1.1 乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。5.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.3 无水硫酸镁（MgSO4）。5.1.4 氯化钠（NaCl）。标准品 5.2.1 氯霉素（CAP，Chloramphenicol，CAS 号：56-75-7）：纯度98%。5.2.2 内标：氘代氯霉素（CAP-D5，Chloramphenicol D5，CAS 号：202480-68-0）：纯度98%。标准溶液制备 5.3.1 氯霉素标准储备溶液（100g/mL）：精密称取氯霉素标准品
5、 10mg（精确到 0.1 mg），用甲醇溶解并稀释定容 100mL 容量瓶中，制成浓度为 100g/mL 的标准储备溶液。18保存，有效期 1 年。5.3.2 内标储备溶液（100g/mL）：精密称取氘代氯霉素 10mg（精确到 0.1 mg），用甲醇溶解并稀DB 43/T 25872023 2 释至 100mL 容量瓶中，制成浓度为 100g/mL 的内标储备溶液。18保存，有效期年。5.3.3 氯霉素标准中间溶液（1g/mL）：精密量取 100L 氯霉素标准储备溶液，用甲醇稀释定容至10mL 容量瓶中，制成浓度为 1g/mL 的标准中间溶液。5.3.4 氯霉素标准中间溶液（100ng/m
6、L）：精密量取 1mL 氯霉素标准储备溶液，用甲醇稀释定容至 10mL容量瓶中，制成浓度为 1g/mL 的标准中间溶液。5.3.5 氯霉素标准中间溶液（10ng/mL）：精密量取 100L 氯霉素标准中间溶液（5.3.3），用甲醇稀释定容至 10mL 容量瓶中，制成浓度为 10ng/mL 的标准中间溶液。5.3.6 内标中间溶液（1g/mL）：精密量取 100L 内标储备溶液，用甲醇稀释定容至 10mL 容量瓶中，制成浓度为 1g/mL 的内标中间溶液。5.3.7 内标中间溶液（10ng/mL）：精密量取 100L 内标中间溶液（5.3.4），用甲醇稀释定容至 10mL容量瓶中，制成浓度为 1
7、0ng/mL 的内标中间溶液。材料 5.4.1 石墨化炭黑（GCB）：40120 m。5.4.2 C18 固相萃取柱：200mg/3mL，或相当者。5.4.3 微孔滤膜（水相）：0.22m。6 仪器与设备 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。分析天平：感量 0.0001g 和 0.01g。超声波清洗器。旋涡混合器。离心机：转速不低于 6000r/min。氮吹仪。组织捣碎机。固相萃取装置。7 试样的制备与保存 试样的制备 取适量空白或供试样品，均质。a)取均质后的供试样品，作为供试试料；b)取均质后的空白样品，作为空白试料；c)取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。试样
8、的保存 常温保存。8 分析测定 提取 DB 43/T 25872023 3 称取试样1 g（精确到0.001 g），加入200L内标中间溶液（5.3.7）、5 mL水，涡旋振荡1 min，加入10 ml乙酸乙酯，涡旋振荡2 min，超声提取10 min。加入1 g MgSO4和1 gNaCl，涡旋振荡1 min，6000 r/min离心5 min，取上清液，备用。净化 取上清液(8.1)6 mL，加入500 mg GCB，涡旋振荡2 min，3000 r/min离心3 min，取上清液5 mL，45氮吹至近干，用5mL水复溶，备用。C18固相萃取柱中用5mL水活化，将复溶液（8.2）全部注入已
9、活化的C18固相萃取柱中，使样液保持20滴/min的速度通过固相萃取柱，再用5 mL水淋洗，抽干，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45氮吹至近干，加1.0mL水溶解，过0.22m微孔滤膜（5.4.3），液相色谱-串联质谱测定。标准曲线的制备 按表1精密量取氯霉素标准中间液和内标标准工作液，用流动相稀释成氯霉素浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL，内标浓度均为1ng/mL的氯霉素标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。以测得特征离子质量色谱峰外标和内标峰面积比为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数
10、。表1 标准工作曲线配制方法 项目 0.1ng/mL 0.2ng/mL 0.5ng/mL 1ng/mL 2ng/mL 5ng/mL 10ng/mL CAP 10L 20L 50L 100ng/mL CAP 10L 20L 50L 10ng/mL CAP-D5 100L 100L 100L 100L 100L 100L 测定 8.4.1 液相色谱参考条件 a)色谱柱：C18，2.1 mm100 mm，1.7 m 或相当者；b)流动相：甲醇-水（流动相梯度见表 2）；c)柱温：35；d)进样量 5L。表2 流动相梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min）水（%）甲醇/（%）0 0.2 70
11、 30 5.0 0.2 5 95 7.0 0.2 5 95 7.1 0.2 70 30 8.0 0.2 70 30 8.4.2 质谱参考条件 a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：负离子扫描；DB 43/T 25872023 4 c)离子源温度：550；d)电喷雾电压：4500V；e)气帘气（CUR）：275.8MPa；f)雾化气（GS1）：275.8MPa；g)辅助气（GS2）：344.75MPa；h)碰撞气（CAD）：55.16MPa；i)检测方式：多反应监测（MRM）；j)氯霉素、氘代氯霉素质谱参数见表 2。表3 氯霉素质谱参数 化合物 定量离子对 定性离子对 驻留时间（msec）去簇
12、电压(DP)V 碰撞电压(CE)V 碰撞室出口电压（CXP）V 氯霉素 321/151.7 321/151.7 100 74 24 10 321/256.8 100 74 17 10 氘代氯霉素 326.2/157.2 326.2/157.2 100 94 24 10 注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。8.4.3 定性测定 在相同试验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在2.5%之内；且试样中定性、定量离子的相对丰度比与浓度接近的标准溶液中对应的定性、定量离子的相对丰度比进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，可判定为试样中含有对
13、应的待测物。表4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度（%）允许偏差 50 20 2050 25 1020 30 10 50 8.4.4 定量测定 取样品溶液和相应的标准溶液经液相色谱-串联质谱测定，按内标法定量。待测物的响应值均应在线性范围内。空白试验 除不称取试样外，按照8.18.4的规定进行平行操作。平行试验 按照8.18.4的规定，对同一试样进行平行试验。9 结果计算 按公式（1）计算试样中氯霉素含量：DB 43/T 25872023 5 X=CCA (1)式中：X供试试样中氯霉素残留量,g/kg；C试样溶液中氯霉素内标浓度,g/L；C标准溶液中氯霉素浓度，g/L；标准溶液中
14、氯霉素内标浓度，g/L；试样溶液中氯霉素峰面积；试样溶液中氯霉素内标峰面积；标准溶液中氯霉素峰面积；A 标准溶液中氯霉素内标峰面积；样品溶液所代表试样的质量，g；溶解残渣的体积，mL；计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，并扣除空白值，结果保留三位有效数字。10 测定方法的线性范围、灵敏度、准确度、精密度 线性范围 本方法氯霉素线性范围为0.1 g/L-5 g/L。灵敏度 本方法中氯霉素检测低限为0.3g/kg，定量限为1.0g/kg。准确度 本方法中氯霉素添加浓度为0.3g/Kg-2g/Kg时，回收率范围为74.7-97.2%。重复性与精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。本方法的相对标准偏差10%。DB 43/T 25872023 6 A A 附录A （资料性）氯霉素及其同位素内标的液相色谱-串联质谱图 图A.1 氯霉素及其同位素内标标准溶液液相色谱-串联质谱谱图
