1、 ICS 65.020.30 CCS B43 43 湖南省地方标准 DB 43/T 24732022 滨湖水牛人工授精技术规程 Code of practice for artificial insemination of binhu buff 2022-12-09 发布 2023-03-09 实施湖南省市场监督管理局发 布 DB 43/T 24732022 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 牛基本条件.1 5 冷冻精液的贮存.1 6 输精准备.2 7 母牛发情鉴定.2 8 输精.2 9 妊娠检查.3 10 记录内容.3 附录 A（规范性）A
2、 输精器具的清洗和消毒.4 附录 B（规范性）发情外部表现症状、外生殖器官和卵巢的变化.5 附录 C（资料性）妊娠特异性糖蛋白（PAGs）诊断.6 附录 D（资料性）配种记录表.7 DB 43/T 24732022 II DB 43/T 24732022 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省畜牧兽医研究所、湖南省光大牧业科技有限公司、湖南生物机电职业技术学
3、院、浏阳市农业发展事务中心，长沙市动植物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：张佰忠、段洪峰、刘海林、朱立军、宋武、张翠永、李剑波、易康乐、樊志坚、刘东翔、文贵辉、李安定、薛爽、赵晓。DB 43/T 24732022 1 滨湖水牛人工授精技术规程 1 范围 本文件规定了滨湖水牛冷冻精液人工授精的冷冻精液与母牛要求、冷冻精液的贮存、输精准备、母牛发情鉴定、输精、妊娠检查、记录等技术要求。本规程适用于滨湖水牛人工授精。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修
4、改单）适用于本文件。GB/T 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。冷冻精液 frozen semen 经特殊方法处理，超低温冷冻后可在液氮中（-196）长期保存的精液。注：本文件冷冻精液特指细管冷冻精液。冷冻精液解冻 thawing of frozen semen 冷冻精液使用前使冷冻精子重新恢复活力的处理方法。发情鉴定 estrus detection 通过外部观察或其他方法确定母牛发情程度的方法。4 牛基本条件 精液品质 应符合 GB 4143的要求。母牛 健康、繁殖机能正常的发情母牛。5 冷冻精液的贮存 DB 43/T 24
5、732022 2 冷冻精液应浸泡在液氮生物容器中贮存，液氮生物容器应符合 GB/T 5458 有关规定。包装好的冷冻精液由一个液氮容器转换到另一液氮容器时，在液氮容器外停留时间不得超过5s。6 输精准备 人员准备 配种员应修剪平指甲，戴好口罩，戴上手套。器具准备 接触精液和母牛生殖道的输精用器具均应按附录A要求清洗和消毒。冷冻精液解冻 冷冻精液的解冻方法应符合 GB 4143的要求。精液质量检查 精液质量应符合 GB 4143的要求。牛体卫生 输精前，用手掏净母牛直肠宿粪后，再用温水清洗母牛外阴部，消毒后擦拭干净。输精装枪 6.6.1 采用金属输精器。6.6.2 剪去细管精液封口，剪口应正，断
6、面应齐。6.6.3 将剪去封口的细管精液迅速装入输精器管内，步骤为：剪去封口端的为前端，输精器推杆后退，细管装至管内，输精器插入塑料外套管，管口顶紧外套管中固定圈，输精器管前推到头，外套管后部与输精器后部螺纹处拧紧，卡式的外套则应推入卡槽里，全部结合应紧密。7 母牛发情鉴定 外部观察 通过母牛的外部表现症状和外生殖器官的变化判断母牛是否发情和发情程度，见附录B。直肠检查 通过直肠检查卵巢，触摸卵泡发育程度，判断发情程度及排卵时间，见附录 B。8 输精 输精时间确定 8.1.1 触摸卵泡 在卵泡壁薄、满而软、有弹性和波动感明显接近成熟排卵时输精一次；6 h10 h卵泡仍未破裂，再输精一次。DB
7、43/T 24732022 3 8.1.2 外部观察法 母牛接受爬跨后8 h12 h是适宜输精时间。如采用两次输精，第二次输精时间为母牛接受爬跨后12 h24 h。青年母牛的输精时间宜适当提前。输精部位 子宫体，即子宫颈后端与子宫角间沟分岔部中间部位。直肠把握输精法 输精员一手五指并握，呈圆锥形从肛门伸进直肠，动作要轻柔，在直肠内触摸并把握住子宫颈，使子宫颈把握在手掌之中，另一手将输精器从阴道下口斜上方约45角向里轻轻插入，双手配合，输精器头对准子宫颈口，轻轻旋转插进，过子宫颈螺旋状皱壁到达子宫体2 cm3 cm即为输精部位，把输精器推杆缓缓向前推动细管中棉塞，将精液注入子宫体，再缓慢撤出输精
8、器。一头母牛应使用一支消毒塑料输精外套管。9 妊娠检查 外部观察 妊娠母牛外部表现发情周期停止，食欲增进，毛色润泽，性情变温和，行为变安稳。怀孕中后期腹围增大，腹壁一侧突出，甚至可观察到胎动，乳房胀大。直肠检查 输精后第二个情期未发情（40 d左右），通过直肠触摸检查子宫，可查出两侧子宫角不对称，孕侧子宫角较另侧略大，且柔软。60 d后直肠触摸孕侧子宫角增大，可触摸到胎囊。直肠触摸妊娠侧卵巢较另侧略大，并有妊娠黄体，黄体质柔软、丰满，顶端能触感突起物。超声波诊断 用B超检查母牛的子宫及胎儿、胎动、胎心搏动等。妊娠特异性糖蛋白（PAGs）诊断 对配种28 d后的牛采血，用检测试剂盒（PAG-EL
9、ISA）测定PAGs，按检测试剂盒说明书操作，或按附录C规定操作。10 记录内容 包括母牛号、公牛号、母牛发情时间、发情情况、输精时间、配种次数、输精员、孕检结果。记录内容以表格方式记录，见附录D。DB 43/T 24732022 4 A A 附录A （规范性）A 输精器具的清洗和消毒 A.1 玻璃器皿 使用前用水浸泡和洗涤，有污物的宜用加洗涤剂的温热水或重络酸钾洗液浸泡数小时后，用水洗净 凉干备用。玻璃输精管放置在电热干燥箱 160 保持 0.5 h，自然冷却后待用。A.2 金属器械 金属类输精器洗净后，置电热干燥箱 120 保持 l h，自然冷却待用。DB 43/T 24732022 5
10、B B 附录B （规范性）发情外部表现症状、外生殖器官和卵巢的变化 表B.1 发情外部表现症状、外生殖器官和卵巢的变化 发情阶段 发情初期（不接受爬跨期）发情盛期（接受爬跨期）发情末期（拒绝爬跨期）发情外部表现症状 母牛兴奋不安，哞叫，游走，采食渐少，泌乳牛产奶量降低，追逐、爬跨它牛而它牛爬跨不予接受，一爬即跑。母牛游走减少，其它牛爬跨时站立不动、后肢张开，频频举尾，接受爬跨。母牛转入平静，其它牛爬跨时，臀部避开，但很少奔跑。外生殖器官变化 阴户肿胀、松弛、充血、发亮，子宫颈口微张，有稀薄透明黏液流出，阴道壁潮红。子宫颈口红润开张，阴道壁充血，黏液显著增加，流出大量透明而黏稠的分泌物。黏液量减
11、少，混浊黏稠。子宫颈口紧闭，有少量浓稠黏液，阴唇消肿起皱，尾根紧贴阴门。卵巢变化 卵巢变软，光滑，有时略有增大，卵泡开始生长，并突出于卵巢表面。卵巢增大，卵泡突出变大，直径 0.5 cm1.0 cm。卵泡增大，波动明显，泡壁由厚变薄。DB 43/T 24732022 6 C C 附录C （资料性）妊娠特异性糖蛋白（PAGs）诊断 C.1 采集血样品 用一次性采血针和5 mL采血管，对配种28 d30 d的母牛尾根酒精消毒采血2 mL3 mL,采血管做好标记和填写采样单，静置1 h，3000 g离心10 min，离心后血清可直接用于检测，不立即检测的血清转入新的离心管，在-20 冰箱内保存。C.
12、2 准备检测用品 准备手套、吸管、洗瓶、移液枪、枪头、恒温箱，酶标仪等，将试剂盒、样品恢复至室温，摇匀试剂。C.3 加样反应 C.3.1 将微孔板置于平整干净的台面上，用吸管分别向微孔内加入50 L缓冲液，再加标准品（阳性对照和阴性对照）和待测样品150 L填写加样登记单，记录下每个微孔的位置，确认加样准确无误。C.3.2 用封口膜将微孔板密封以防蒸发，轻轻摇匀，在20 的恒温培养箱孵育1 h。C.3.3 孵育后，去掉膜，翻转微孔板，倒掉孔内液体，再用洗液清洗微孔4次。C.3.4 洗涤后，向微孔内加入检测溶液，轻轻摇匀，随后在20 的恒温培养箱孵育1 h。C.3.5 孵育后，重复步骤A.3.3的洗板过程。C.3.6 洗涤后，再向孔内加入酶标抗体，轻轻摇匀几次，随后在20 的恒温培养箱孵育1 h。C.3.7 孵育后，重复步骤A.3.3的洗板过程。C.3.8 加入显色液孵育10 min，再加入终止液即可观察颜色变化。C.4 结果判断 阳性：阳性对照孔和样品孔呈蓝色。阴性：阳性对照孔呈蓝色，样品孔无颜色 可疑：阳性对照孔呈蓝色，样品孔颜色很淡。复检1次。DB 43/T 24732022 7 D D 附录D （资料性）配种记录表 表D.1 配种记录表 序号 母牛号 公牛号 发情时间 发情情况 输精时间 配种次数 孕检结果 输精员 备注 1 2 3 4 5
