1、ICS 65.020.30 CCS B 44 DB36 江西省地方标准 DB36/T 19032023 实验动物 小鼠肝炎病毒荧光定量 PCR 检测方法 Laboratory animalreal-time quantitative PCR method for examination of mouse hepatitis virus 2023-12-11 发布 2024-06-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 19032023 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.2 5 设备和材料.2 6 试剂.2 7 检测流
2、程.2 8 结果判定.4 附录 A（规范性附录）溶液配制方法.5 附录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 的引物与探针.6 附录 C（规范性附录）荧光定量 PCR 检测方法.7 参 考 文 献.8 DB36/T 19032023 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：贾菠、周银平、张陆兵、谢金明、万筱荣、熊莉娟、肖芳平、罗勇兵、刘欢、周剑、李银
3、才。DB36/T 19032023 1 实验动物 小鼠肝炎病毒荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测的术语和定义、缩略语、设备和材料、试剂、检测流程和结果判定等内容。本文件适用于小鼠肝炎病毒的检测，饲养环境中小鼠肝炎病毒的检测参照执行。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922 实验动物 微生物、寄生虫学等级及监测 GB
4、 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 39760 实验动物 安乐死指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 小鼠肝炎病毒 mouse hepatitis virus 直径为80nm160nm的球形RNA病毒，属于冠状病毒科的冠状病毒属，是影响小鼠健康最为重要的病毒之一，小鼠肝炎为小鼠肝炎病毒感染所致。3.2 荧光定量聚合酶链式反应 real-time quantitative polymerase chain reaction;real-time PCR 在常规PCR的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和
5、一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。3.3 Ct 值 cycle threshold value DB36/T 19032023 2 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核酸(ribonucleic
6、acid)cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementary DNA)PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）Taq酶：Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)DEPC：焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)5 设备和材料 5.1 设备 设备包括但不限于：高压灭菌锅、荧光定量PCR仪、PCR仪、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、漩涡振荡器、组织匀浆器、生物安全柜、超净工作台、冰箱（4、-80）、微量移液器（0.2 L2 L、2 L20 L、20 L200 L、1
7、00 L1000 L）。5.2 材料 无RNA酶离心管（0.2 mL、1.5 mL、5 mL、15 mL）、灭菌PCR扩增反应管、无RNA酶吸头、无菌剪刀、无菌镊子、灭菌棉拭子等。6 试剂 6.1 本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水应符合 GB/T 6682 的要求。6.2 灭菌 PBS 溶液（配制方法见附录 A 中的 A.1）。6.3 DEPC 水（配制方法见附录 A 中的 A.2）。6.4 Trizol 裂解液：或其他等效裂解液。6.5 三氯甲烷。6.6 异丙醇：-20预冷。6.7 75%乙醇（配制方法见附录 A 中的 A.3）。6.8 RNA 逆转录试剂盒：商品化逆转录试剂盒。
8、6.9 荧光定量 PCR 试剂盒：商品化荧光定量 PCR 试剂盒。6.10 引物和探针（见附录 B 中的 B.1）。6.11 阳性对照：小鼠肝炎病毒阳性 cDNA 片段。6.12 阴性对照：小鼠肝炎病毒阴性 cDNA 片段。7 检测流程 7.1 生物安全要求 DB36/T 19032023 3 实验操作及处理按照 GB 19489 的规定执行。检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 19495.2 中的要求执行。采样参照 GB 14922 中的要求执行。7.2 样本采集 7.2.1 脏器组织 按照GB/T 39760的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的肝脏，剪取待检样本2.0 g于1
9、5 mL无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.2.2 粪便/盲肠内容物 无菌采集动物盲肠内容物或粪便，取待检样本2.0 g于15 mL无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.2.3 实验动物垫料 取实验动物垫料1.0g于15 mL无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.3 样本处理 7.3.1 脏器组织 在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入 4 mL 灭菌 PBS 溶液，使用电动匀浆器充分匀浆 2 min，反复冻融 3 次，然后将组织悬液在 4，3000 g 离心 10 min，取上清液转入另一 5 mL 无 RNA 酶离心管中，编号备用。7.3.2 粪便/盲肠内容物 在生物安全柜内
10、向装有样品的离心管中加入4 mL灭菌PBS溶液，使用电动匀浆器充分匀浆2 min，12000 g离心10 min，取上清液转入另一5 mL无RNA酶离心管中，编号备用。7.3.3 实验动物垫料 在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入 4 mL 灭菌 PBS 溶液（可适量增加灭菌 PBS 溶液的量，饲料和垫料需全部浸泡于液体中），静置 30 min，取上清液转入另一 5 mL 无 RNA 酶离心管中，编号备用。7.4 样本存放 采集或处理的样本在 2 8 条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置于-80 冰箱保存，避免反复冻融。7.5 样本 RNA 提取 7.5.1 样本 RNA 在实
11、验室中提取步骤如下：a)为防止 RNA 降解，所用试验用具及溶液应无 RNA 酶，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套；b)取 200 L 已处理好的样品加入到无 RNA 酶的 1.5mL 离心管中，加入 600 L Trizol 裂解液，用旋涡振荡器剧烈振荡 15s 后，室温放置 5min；c)加入 200 L 三氯甲烷，用旋涡振荡器剧烈振荡 15s 后，室温放置 3min，4，12000 g 离心 15min；d)吸取上清液转移至一个新的无 RNA 酶的 1.5mL 离心管中，加入 500 L 异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置 10min；DB36/T 19032023 4 e)4，1200
12、0 g 离心 15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除；f)加入 1000 L 预冷的 75乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀；g)4，12000g 离心 15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀 10min；h)加入 20 L DEPC 水，溶解沉淀后，室温孵育 10min。提取的 RNA 应在 2h 内使用或80冰箱保存备用。7.5.2 样本 RNA 也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6 样本 RNA 逆转录为 cDNA 反应体系的配制应在冰上操作。5逆转录反应缓冲液 4 L、MgCl2(25 mM)4 L、Oligo Prime
13、r(500 g/ml)0.5 L、Random Primers(500 g/mL)0.5 L、PCR Nucleotide Mix 1 L、核糖核酸酶抑制剂 0.4 L、反转录酶 1 L、RNA 1 g2 g，用无 RNA 酶水补足反应体积至 20 L，置于 PCR 仪中进行逆转录反应，以 40 15min、70 15min 的程序进行一个循环。制备好的 cDNA 模板若暂时不进行 PCR 反应，应保存于-80冰箱。也可选用其它等效逆转录试剂盒进行逆转录反应。7.7 荧光定量 PCR 检测 荧光定量PCR检测应符合附录C。8 结果判定 8.1 质控标准 阳性对照 Ct 值35，且出现对数扩增曲
14、线。阴性对照及空白对照无 Ct 值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2 检测结果判定 符合 8.1 条件下，被检样本 Ct 值35，且出现对数扩增曲线，判定为阳性；被检样本无 Ct 值且无对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本 35Ct 值40 时，重复一次，如果 Ct 值仍然40，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。DB36/T 19032023 5 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制方法 A.1 灭菌 PBS 溶液 准确称取氯化钠（NaCl）8.00 g，氯化钾（KCl）0.20 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24 g，磷酸氢二钠（Na2HPO41
15、2H2O）3.65 g，先加入 800 mL 去离子水溶解，调节溶液 pH 至 7.2 7.4，定容至 1000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min，冷却备用。A.2 DEPC 水（无 RNA 酶超纯水）取超纯水100 mL，加入焦炭酸二乙酯（DEPC）50 mL，室温过夜后，在103.4 kPa（121）条件下 灭菌15min，冷却备用。A.3 75%乙醇 取无水乙醇75 mL，加入25 mL无RNA酶超纯水，现配现用。DB36/T 19032023 6 B B 附 录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 的引物与探针 B.1 引物与探针序列 正向引物 5-GGAA
16、CTTCTCGTTGGGCATTATACT-3 反向引物 5-ACCACAAGATTATCATTTTCACAACATA-3 探针 FAM-ACATGCTACGGCTCGTGTAACCGAACTGT-BHQ-1 注：探针可选用具有与FAM和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。DB36/T 19032023 7 C C 附 录 C（规范性附录）荧光定量 PCR 检测方法 C.1 荧光定量PCR反应体系 反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。以含有小鼠肝炎病毒的组织或细胞培养物提取的 RNA 反转录后的 cDNA 作为阳性对照模板，以不含有小鼠
17、肝炎病毒的 cDNA 样本（可以是正常动物组织或正常细胞培养物）作为阴性对照模板，以无菌蒸馏水作空白对照。表C.1 每个荧光定量 PCR 反应体系 反应组分 用量 终浓度 Probe qPCR Mix（2）10L 1 正向引物（10mol/L）0.8L 400nmol/L 反向引物（10mol/L）0.8L 400nmol/L 探针（10mol/L）0.8L 400nmol/L cDNA 模板 2L-灭菌去离子水 5.6L-总体积 20L-注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。C.2 荧光定量PCR反应条件 表C.2 荧光定量 PCR 反应条件 步骤 温度 时间 釆集荧光信号
18、 循环数 预变性 95 30s-1 变性 95 5s-40 退火，延伸 60 34s 是 注：反应参数可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。DB36/T 19032023 8 参 考 文 献 1 T/CALAS 25-2017 实验动物 小鼠肝炎病毒PCR检测方法 2 熊 炜,蒋 静,张 强,等.小 鼠 肝 炎 病 毒 核 酸 快 速检 测 方 法 的 建 立 和 应 用J.实 验 动 物科学,2013,30(4):1-5 3 王吉,王莎莎,付瑞,等.小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立及在部分啮齿类动物的应用J.实验动物与比较医学,2020,40(2):95-103 4 邵伟娟,高诚,陆国平,等.小鼠肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立和比较研究J.中国实验动物学报,2000,8(1):26-30 _
