1、ICS 65.020.01 CCS B 16 DB36 江西省地方标准 DB36/T 17442023 柑橘裂皮病和柑橘碎叶病 RT-PCR 检测技术规程 Technical specification for detecting Citrus exocortis and Citrus tatter leaf by RT-PCR 2023-02-10 发布 2023-08-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 17442023 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 样品采集.2 5 样品 RNA 制备.2 6 RNA 提取质量评
2、价.3 7 RT-PCR 检测.3 8 电泳及成像分析.5 9 结果判定.5 10 检测后样品的处理.6 附录 A（资料性）柑橘裂皮病基本信息.7 附录 B（资料性）柑橘碎叶病基本信息.8 附录 C（规范性）主要仪器设备和试剂.9 附录 D（规范性）检测试剂和溶液配制.11 DB36/T 17442023 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由赣州市市场监督管理局提出并归口。本文件起草单位：赣南师范大学、国家脐橙工程技术研究中心、赣州市果业发展中心、江西省农业农村产业发展服务中心。本文
3、件主要起草人：卢占军、陈红丽、黄爱军、胡珊玲、谢金招、余海中、钟八莲、姚锋先、苏华楠、易龙、胡威、朱博、王希、曾芳群、陈奕芳、谢廉颉、陈慈相。DB36/T 17442023 1 柑橘裂皮病和柑橘碎叶病 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了柑橘裂皮病和柑橘碎叶病的术语和定义、样品采集、样品RNA制备、RNA提取质量评价、RT-PCR检测、电泳及成像分析、结果判定、检测后样品的处理。本文件适用于柑橘类植物材料中疑似感染柑橘裂皮病或柑橘碎叶病的病原检测和病害鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注明日期的版本适用于本文件。凡是不注明日
4、期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 37874-2019 核酸提取纯化方法评价通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 柑橘裂皮病 Citrus exocortis disease 由柑橘裂皮病类病毒引起的柑橘病害，参见附录A。3.2 柑橘碎叶病 Citrus tatter leaf disease 由柑橘碎叶病毒引起的柑橘病害，参见附录B。3.3 柑橘裂皮病的病原 Citrus exocortis viroid(CEVd)一种类病毒，没有蛋白质衣壳，是游离的低分子量核糖核酸（RNA），病原可通过嫁接、修剪工具传播。3.4 柑橘碎叶病的病原 Ci
5、trus tatter leaf virus（CTLV）发状病毒属，病毒粒子为曲杆状，基因组是单链正义RNA分子，病原可通过嫁接、机械和菟丝子传播。3.5 DB36/T 17442023 2 反转录-聚合酶链式反应 RT-PCR 经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。3.6 扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标核酸序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3.7 扩增模板 template DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。4 样品采集 4.1 取样物品 枝剪、剪刀等工具类，使用前后应（1212）高压灭菌20 min；
6、样品袋、刀片、手套等耗材类应一次性使用，避免样品间相互污染。4.2 取样方法 从树冠东、南、西、北四个方向各采集中部枝条1支，每支枝条至少带3片叶片，叶片为当年生，新叶或成熟叶片，带叶片枝条装入密封袋中，标记并放入冰盒中保鲜处理，及时送交实验室检验。采集的样品在28条件下保存应不超过1周，若需长期保存，应置于-70以下保存。5 样品 RNA 制备 5.1 检测样品均一化与切取 来自一棵采样树的所有枝条均应随机选取3-4个叶片，用一次性无菌刀片切取叶片主脉两侧0.5cm1.0 cm的侧脉组织，再切成长度0.1 cm以下的碎屑，越碎越好，混合所有来自叶片侧脉组织碎屑达100 mg以上。5.2 采用
7、 TriZol 法制备样品 RNA，操作步骤：1)取上述叶片侧脉组织碎屑，加液氮研磨成粉末状，迅速称取约 100 mg 作为测试样品，装入 1.5 mL 离心管，加入 1000 L 的 TriZol 试剂，振荡器上剧烈震荡 15 s，冰上静置 15 min。2)将上述样品 4下，12000g 离心 5 min，吸取上清液约 500 L，转移到新的 1.5 mL 离心管内，加入 200 L 氯仿-异戊醇溶液，振荡器上剧烈震荡 10 s 后，放置于冰上 5 min。3)将上述样品 4下，12000g 离心 10 min，吸取上清液约 200 L，转移到新的 1.5 mL 离心管内，加入等体积 4预
8、冷的异丙醇溶液约 200 L，上下轻柔颠倒离心管，-20下静置 1小时。DB36/T 17442023 3 4)将上述样品 4下，12000g 离心 10 min 后，弃除上清液，冰上加入 4预冷的 75%乙醇溶液 1 mL，上下颠倒离心管洗涤沉淀，4下 12000g 离心 5 min 收集半透明状沉淀，再用 75%乙醇溶液 1 mL 重复洗涤 2 次，最后 4下 12000g 离心 5 min 后收集沉淀，吸取离心管内残余液。5)将上述样品放置于生物安全柜内通风干燥 5 min，加入适量 DEPC 处理水溶解（约 20 L-60 L），-20保存，作为后续 RT-PCR 检测的待测样品模板。
9、6 RNA 提取质量评价 依据GB/T 37874-2019对提取的RNA样品进行质量评价。起始样品为100 mg叶片，提取到的总RNA产量500 ng。纯RNA的OD260/OD280为2.0，当RNA提取溶液的OD260/OD280在1.72.0时表明RNA纯度基本可以满足后续 RT-PCR检测需要。所制备的RNA样本在4条件下保存应不超过7天，在-20冻存不超过30 天，避免反复冻融。7 RT-PCR 检测 7.1 cDNA 第一链合成体系 冰上操作按下表1加入DEPC处理水、dNTP、随机引物6N，RNA模板于PCR反应管中，混匀并低速离心，转入PCR扩增仪中反应。PCR反应程序：65
10、 预变性 5 min。取出后立即冰水浴5 min。表1 cDNA 第一链合成体系 检测试剂 终浓度 每管加入量/L 随机引物 6N 10 M 1 M 1 dNTP 2.5 mM 0.25 mM 1 RNA 模板 3 DEPC 处理水 5 总体积 10 冰上操作按下表2向上述PCR反应管中加入DEPC处理水、RT缓冲液、RRI、M-MLV，即体系和体系合并20L，混匀并低速离心，转入PCR扩增仪中反应。PCR反应程序：30 10 min，42 50 min，75 15 min。合成产物备用。DB36/T 17442023 4 表2 cDNA 第一链合成体系 检测试剂 终浓度 每管加入量/L RT
11、 缓冲液5 2 4 RNA 酶抑制剂（RRI）40 U/L 2U/L 0.5 反转录酶（M-MLV）200 U/L 20 U/L 1 DEPC 处理水 4.5 总体积 10 7.2 PCR 扩增体系 7.2.1 柑橘裂皮病 PCR 扩增体系 （1）柑橘裂皮病扩增引物序列：柑橘裂皮病正向引物：5-CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3；柑橘裂皮病反向引物：5-GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3；（2）柑橘裂皮病 PCR 体系配置，见表 3。表3 柑橘裂皮病 PCR 扩增体系 检测试剂 终浓度 每管加入量/L cDNA 第一链合成产物 1 PCR 缓冲液 10 1 2.5 dN
12、TP 2.5 mM 0.2 mM 2.0 柑橘裂皮病正向引物10 M 0.2 M 0.5 柑橘裂皮病反向引物10 M 0.2 M 0.5 Taq 酶5 U/L 0.1 U/L 0.5 DEPC 处理水 18 总体积 25.0 冰上操作按表2加入PCR缓冲液、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、cDNA第一链合成产物于新的PCR反应管中，混匀并低速离心，转入PCR扩增仪中扩增。PCR反应程序：94 2 min；32个循环(94 20 s，58 20 s，72 45 s)；72 10 min。反应结束，取出扩增产物4下保存备用。检测时同时设阴性对照、柑橘裂皮病阳性对照和水空白对照。7.2.2
13、柑橘碎叶病 PCR 扩增体系 （1）柑橘碎叶病扩增引物序列：DB36/T 17442023 5 柑橘碎叶病正向引物：5-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3；柑橘碎叶病反向引物：5-AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3；（2）柑橘碎叶病 PCR 体系配置，见表 4 表4 柑橘碎叶病 PCR 扩增体系 检测试剂 终浓度 每管加入量/L cDNA 第一链合成产物 1 PCR 缓冲液10 1 2.5 dNTP2.5 mM 0.2 mM 2.0 柑橘碎叶病正向引物10 M 0.2 M 0.5 柑橘碎叶病反向引物10 M 0.2 M 0.5 Taq 酶5 U/L 0.1 U/L 0.5
14、DEPC 处理水 18 总体积 25.0 冰上操作按表2加入PCR缓冲液、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、cDNA第一链合成产物于新的PCR反应管中，混匀并低速离心，转入PCR扩增仪中扩增。PCR反应程序：94 3 min；32个循环(94 20 s，60 20 s，72 45 s)；72 10 min。反应结束，取出扩增产物4下保存备用。检测时同时设阴性对照、柑橘碎叶病阳性对照和水空白对照。8 电泳及成像分析 分别将PCR扩增产物与上样染料混匀后，加入到1.2%琼脂糖凝胶点样孔中，同时设置DNA Marker标准分子量作为标记片段大小的标准，在 1.2%琼脂糖凝胶中 150 V 电压
15、电泳 30 min。将电泳后的琼脂糖凝胶经核酸染料染色后置于凝胶成像系统观察，分析结果并成像保存。9 结果判定 9.1 样品结果判定 9.1.1 柑橘裂皮病判定 样品RT-PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，琼脂糖凝胶上阳性对照出现一条371 bp大小的特异性条带，阴性对照和空白对照没有该特异性条带；供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品结果为阳性，即感染了柑橘裂皮病毒；供试样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品结果为阴性，即不带柑橘裂皮病毒。9.1.2 柑橘碎叶病判定 样品RT-PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，琼脂糖凝胶上阳性对照出现一条889 bp大小的特异性条带，阴性对
16、照和空白对照没有该特异性条带；供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品结DB36/T 17442023 6 果为阳性，即感染了柑橘碎叶病毒；供试样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品结果为阴性，即不带柑橘碎叶病毒。9.2 样品对照结果 9.2.1 柑橘裂皮病样品对照结果 阴性对照及空白对照371 bp处无特异性条带。否则，此次检验视为无效。阳性对照的371 bp处出现特异性条带。否则，此次检验视为无效。9.2.2 柑橘碎叶病样品对照结果 阴性对照及空白对照889 bp处无特异性条带。否则，此次检验视为无效。阳性对照的889 bp处出现特异性条带。否则，此次检验视为无效。10 检
17、测后样品的处理 总核酸提取液放置于-20以下，以备用于柑橘裂皮病或柑橘碎叶病复核检测。经鉴定后的RNA样品，建档标记清楚，-80可保存六个月。用于柑橘裂皮病或柑橘碎叶病检测的样品、用具在完成检验后，用具应进行灭活处理，样品应集中销毁。DB36/T 17442023 7 附 录 A（资料性）柑橘裂皮病基本信息 A.1 中文名：柑橘裂皮病 A.2 学名：柑橘裂皮病 A.3 异名：柑橘剥皮病 A.4 病害英文名：Citrus exocortis A.5 病害病原：Citrus exocortis viroid(CEVd)，为一种类病毒，没有蛋白质衣壳，是游离的低分子量核糖核酸，具有高度的稳定性，带有
18、CEVd韧皮部汁液在110下保持10 min左右，仍具有一定侵染力，被病毒汁液污染的嫁接刀或修枝剪上也能保持2-3个月的感染性。A.6 病株症状：以枳、橙枳、香橼等为砧木的甜橙、宽皮橘或酸橙易感病且症状明显，病树砧木部分外皮纵向开裂和翘起，皮层剥落，木质部外露呈黑色，后呈鳞片状剥落。新梢少或部分小枝枯死，叶片小或叶脉附近绿色叶肉黄化，似缺锌状，病树树势弱但开花多，落花落果严重。枝条纤细，丛生，树冠矮化。整体树势，常年长势慢，或停止生长，比同龄小很多。DB36/T 17442023 8 附 录 B（资料性）柑橘碎叶病基本信息 B.1 中文名：柑橘碎叶病。B.2 学名：柑橘碎叶病 B.3 异名：无
19、 B.4 病害英文名：Citrus tatter leaf B.5 病害病原：Citrus tatter leaf virus（CTLV），为发状病毒属（Capillovirus），CTLV病毒粒子为曲杆状，大小约为（600700）nm（1315）nm。体外病存活4d8d，6570处理10 min可使病毒致死。病毒主要通过嫁接和受污染的工具传播。B.6 病株症状：CTLV在柑橘类中有广泛寄主，在多种柑橘品种上存在隐症现象，只有在一些敏感品种上才出现症状，不同品种、不同接种方式都会引起不同症状。CTLV侵染枳橙、枳檬、枳金柑等枳的杂种和厚皮莱檬等品种引起黄化、嫁接部位不亲和或异常、生长衰弱、结果
20、性能差，严重时枯死。鲁斯克枳橙(Rusk citrange)和特洛亚枳橙(Troyer citrange)是鉴定碎叶病的指示植物，感染后其叶片会出现黄色斑点、扭曲、叶缘畸形、缺刻等典型症状。树势情况，发病植株出现矮化、生长瘦弱等症状，叶片黄化(与环状剥皮引起的黄化类似)、脱落，结果很少，甚至枯死。砧穗接口：病株的砧穗接合部环缢和接口以上的接穗部肿大。剥开接合部树皮，可见接穗与砧木的木质部间有一圈缢缩线。受强风等外力推动，病树砧穗接合处易断裂，裂面光滑。A DB36/T 17442023 9 附 录 C（规范性）主要仪器设备和试剂 C.1 主要仪器设备与实验器具 除非另有说明，实验器具均用 DE
21、PC 水清洁处理或购买无 DNA/RNA 酶的实验器具：PCR 扩增仪。髙速台式离心机。生物安全柜或超净工作台。冰箱(冷藏室 4和冷冻室-20)。涡旋混匀仪。制冰机。微量可调移液器（1000 L、200 L、10 L）。核酸电泳仪、电泳槽。凝胶成像系统 超纯水仪。高压灭菌锅。微量核酸测定仪。离心管（0.5 mL、1.5 mL、2.0 mL）PCR 反应管。吸头（1000 L、200 L、10 L）C.2 主要试剂 除非另有说明，本标准所用试剂均为生物试剂（BR）：焦碳酸二乙酯（DEPC）。RNA 抽提试剂（TriZol）。氯仿-异戊醇（24：1）。异丙醇，分析纯试剂。无水乙醇，分析纯试剂。DB
22、36/T 17442023 10 四甲基乙二胺二钠盐（EDTA-Na2），分析纯试剂。三羟甲基氨基甲烷（Tris），优级纯试剂。浓盐酸（HCl），分析纯试剂。冰醋酸，分析纯试剂。蔗糖，分析纯试剂。溴酚蓝，分析纯试剂。氢氧化钠，分析纯试剂。二甲苯青 FF。随机引物 6N。RT 缓冲液5PCR buffer。dNTP 2.5 mM：脱氧核糖三磷酸腺苷混合物。反转录酶(M-MLV)200 U/L。酶抑制剂（RRI）40 U/L。100bp 梯度 DNA 标准分子量（Marker）：100 bp DNA ladder。电泳缓冲液（50TAE）。琼脂糖。核酸染色剂。样品缓冲液：6Loading Buff
23、er。PCR 缓冲液10PCR buffer。DNA 聚合酶5 U/L。DB36/T 17442023 11 附 录 D（规范性）检测试剂和溶液配制 除非特殊说明，本标准所有试剂配制均用DEPC处理水，4保存备用。含有Tris的溶液不可用DEPC水配制。D.1 DEPC处理水：吸取1mLDEPC溶液用ddH2O水定容到1L，常温磁力搅拌过夜，121 20 min 高压灭菌后使用。D.2 1M Tris-HCl（pH 8.0）：称取24.228 gTris置于250 mL烧杯中，加160 mL ddH2O，充分搅拌溶解，加入浓盐酸9.2 mL，加ddH2O定容至 200 mL，121 20 mi
24、n 高压灭菌后，室温保存。D.3 0.5 M EDTA（pH 8.0）：称取94 g Na2EDTA置于500 mL 烧杯中，加400 mL ddH2O，边搅拌边按加入10.3 g氢氧化钠，加 ddH2O定容至200 mL，121 20 min高压灭菌后，室温保存。D.4 1.2%琼脂糖凝胶：配制1.2%质量体积比的琼脂糖粉与1TAE电泳缓冲液溶液，加热融化成均一琼脂糖溶液，冷却至室温导入插好梳子的制胶槽中，凝固后点样电泳。D.5 电泳缓冲液（50TAE）：称取242 g Tris、37.2 gNa2EDTA2H2O和57.1 mL冰醋酸 于1 L烧杯中，加800 mL 去离子水搅拌溶解，加去
25、离子水定容至1 L，室温保存，使用时稀释至1倍。D.6 上样染料（6Loading Buffer）：（用于分离琼脂糖凝胶电泳DNA/RNA300 bp，蓝色溶液，电泳后分青蓝二带）称取20 g蔗糖、1.12 gNa2EDTA2H2O、0.05 g溴酚蓝、0.05 g二甲苯青 FF下列于100 mL烧杯中，加入36 mL甘油、800 L 5 M NaOH和30 mL的ddH2O溶解，ddH2O定容至100 mL，分装至1.5 mL离心管后-20长期保存，用时取出4存放。D.7 75%乙醇：DB36/T 17442023 12 按无水乙醇：DEPC处理水(V/V)=3：1配制。D.8 1TE(pH 8.0)：在100 mL螺口瓶中加入0.5 mL 1 M Tris-HCl(pH8.0)、0.1 mL 0.5 M EDTA(pH8.0)和50 mL ddH2O，高压灭菌后室温保存备用。D.9 50TAE：称取242gTris，加入57.1mL冰醋酸，100 mL 0.5M的EDTA，PH值调至8.0。定容至1L，使用时配制成1TAE缓冲液。D.10 无菌ddH2O：取ddH2O洁净试剂瓶分装，经 121 20 min高压灭菌后，少量使用分装至1.5 mL离心管，-20储存备用，大量使用室温保存。_
