1、ICS 11.220CCS B 41DB36江西省地方标准DB36/T 17472023新型鹅星状病毒病诊断技术规程Diagnostic technical regulations for novel goose astrovirus disease2023-02-10 发布2023-08-01 实施江西省市场监督管理局发 布DB36/T 174720231I目 次前 言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14临床诊断.15实验室诊断.26综合判定.6附录 A（资料性附录）病毒分离所需仪器设备和试剂耗材.7附录 B（资料性附录）样品的采集、处理、运输及保存.8附录 C（资料性附录
2、）RT-PCR 所需仪器设备和试剂耗材.9附录 D（资料性附录）荧光 RT-PCR 所需仪器设备和试剂耗材.10附录 E（资料性附录）RT-LAMP 方法所需仪器设备和试剂耗材.11附录 F（资料性附录）新型鹅星状病毒 RT-PCR 引物、荧光 RT-PCR 的引物和探针、RT-LAMP 引物 12参 考 文 献.14DB36/T 17472023II前 言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 规定起草。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：江西省农业科学
3、院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：李海琴、张帆帆、康昭风、谭美芳、杨群、曾艳兵、韦启鹏、黄江南、方绍培、谭佳、吴诚诚、季华员。DB36/T 1747202311新型鹅星状病毒病诊断技术规程1范围本文件规定了新型鹅星状病毒病的术语定义、临床诊断、实验室诊断和综合判定技术要求。本文件适用于新型鹅星状病毒病的诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品
4、采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1新型鹅星状病毒 novel goose astrovirus,NGoAstV属于星状病毒科（Astroviridae）禽星状病毒属（Avastrovirus），星状病毒（Astroviruses,AstV）是一种呈球形的RNA病毒，直径为25nm35 nm，病毒表面无囊膜，有5个6个突起，用透射电子显微镜观察呈五角星状或六角星状。3.2新型鹅星状病毒病 novel goose astrovirus disease,NGoAstVD指由新型鹅星状病毒引起的以雏鹅尿酸盐沉积在关节和（或）内脏为主要病理特征的传染病。3.3鸡肝癌细
5、胞系 chicken hepatoma cell line,LMHLMH细胞系是利用患肝细胞癌的鸡肝细胞致突变培育而成，是一种可以持续传代的鸡肝癌细胞系。4临床诊断4.1流行病学病鹅、隐性带毒鹅、带毒种蛋是主要传染源，自然感染的潜伏期是 3 d，该病既可垂直传播、也可DB36/T 174720232水平传播。各品种鹅均易感，5 日龄20 日龄雏鹅最易感，最早可在 3 日龄发病。死亡率 30%40%，最高可超过 50%。4.2临床症状患鹅精神沉郁，食欲减退，饮水量增加，消瘦，四肢瘫痪，排白色稀便，发病高峰期约在 7 日龄14 日龄。4.3病理变化4.3.1剖检病变剖检病理变化主要表现为肾脏呈花斑
6、肾，输尿管尿酸盐沉积，有的关节腔尿酸盐沉积严重，有的心脏、肝脏表面有白色尿酸盐沉积。4.3.2组织学病变患鹅肾小管上皮细胞脱落坏死，管腔内充满粉红色的尿酸盐沉积，肾间质出血，肾小球肿胀；有的心脏组织中心肌纤维排列紊乱、肿胀，有的肝脏可见少量炎性细胞或肝细胞空泡变性。4.4临床诊断结果判定符合4.1流行病学特征、病鹅出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判定为新型鹅星状病毒病疑似病例，应进行实验室确诊。5实验室诊断实验室生物安全要求按照GB 19489执行。5.1病毒分离试验设备和试剂耗材准备见附录A，样品准备见附录B。5.1.1细胞分离5.1.1.1细胞的准备细胞的准备工作包括以下内容：a)在
7、 37 水浴中提前预热消化液（0.25%胰酶）和 DMEM/F12 细胞培养液，将生长良好的 LMH细胞用无菌 PBS 洗涤 2 次，弃去 PBS；b)加入 0.25%胰酶消化为单个细胞，加入细胞培养液，用吸管轻轻吹散细胞，再加入细胞培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散均匀后，按每孔 1 mL 加入到细胞培养瓶；c)在 37 含 5%CO2 的细胞培养箱中培养 24 h36 h，密度达到 80%时，用于细胞分离。5.1.1.2病毒的分离培养病毒的分离培养工作包括以下内容：a)将上述细胞培养液弃掉，用无菌 PBS 洗涤 3 次后，将处理好的样品接种到单层细胞上，每孔0.2 mL0.4 mL；DB36
8、/T 174720233b)放入细胞培养箱 1 h2 h，每隔 15 min 轻轻摇动一次，吸附后弃掉液体，用无菌 PBS 洗涤 3次，加入细胞维持液，每孔 1 mL；c)于 37 含 5%CO2 的细胞培养箱中连续培养 5 d，每天观察细胞状态；d)待细胞液变黄，将细胞培养瓶反复冻融 3 次，细胞液经 5000 rpm 离心 10 min 后取上清用于检测或置于-80 保存。5.1.2鹅胚分离5.1.2.1种蛋准备将种鹅蛋（新型鹅星状病毒阴性）置于孵化器中 37 下孵育 10 d11 d，用于病毒分离。5.1.2.2鹅胚接种将待检样品以0.2 mL/胚的剂量经绒毛尿囊膜途径接种10日龄11日
9、龄鹅胚，37 恒温培养箱中培养，每天照蛋2次，连续观察6 d，并记录死胚情况。5.1.2.3尿囊液收集弃掉接种后24 h内死亡的鹅胚，若接种2 d6 d内鹅胚出现死亡，则收集死亡鹅胚的尿囊液；若接种6 d内鹅胚不出现死亡，则收集6 d活胚的尿囊液。5.2病毒的鉴定5.2.1RT-PCR 技术试验设备和试剂耗材准备见附录C。5.2.1.1病毒 RNA 的提取提取待检组织样品总RNA，提取的RNA立即用于反转录，否则置于-80 冰箱冻存。5.2.1.2病毒 cDNA 的合成采用50 L体系，于无菌无酶EP管中依次加入RNA模板5 L、Buffer缓冲液10 L，随机引物2 L、dNTPs(2.5
10、mM each)4 L、M-MLV反转录酶(200 U/L)1 L，RNA酶抑制剂(40 U/L)2 L，补充无菌水至总体积共50 L，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25 5 min、50 45 min、85 2 min、4 5 min的程序进行一个循环，cDNA合成后进行PCR扩增或于-20保存备用。5.2.1.3PCR 反应体系及反应条件配置PCR反应液，在样品制备区加样。采用25 L反应体系，见表1所示。表 1PCR 反应体系试剂体积（L）2PCR Mix12.5上游引物（10 mol/L）1.0下游引物（10 mol/L）1.0模板cDNA2.0无RNA酶去离子水8.5总体积25.
11、0DB36/T 174720234瞬时离心，置PCR扩增仪内进行扩增，反应程序为95 预变性3 min；然后进入扩增循环：95 30s，55 30 s，72 45 s，35个循环；最后72 延伸8 min，4 结束反应。5.2.1.4PCR 产物检测将制备好的1.0%琼脂糖凝胶放入电泳槽（带加样孔的一端在阴极），倒入电泳液（1TAE）浸过胶面。DNA Marker、阴性对照产物、PCR产物和阳性对照产物各取7 L加入胶孔内，在110 V电压下电泳20 min40 min；在凝胶成像分析系统下观察、拍照，并记录结果。5.2.1.5RT-PCR 结果判定5.2.1.5.1试验成立的条件阴性对照样品
12、无条带，阳性对照样品出现489 bp大小的条带，试验条件成立。必要时，对扩增片段进行序列测定。5.2.1.5.2试验结果的判定在试验成立的前提下，待检样品出现 489 bp 大小的条带，判定待检样品为新型鹅星状病毒 PCR 阳性。否则为阴性，必要时，对扩增片段进行序列测定。5.2.2荧光 RT-PCR 技术试验设备和试剂耗材准备见附录D。5.2.2.1病毒 RNA 的提取同5.2.1.1。5.2.2.2病毒 cDNA 的合成同5.2.1.2。5.2.2.3荧光定量 PCR 反应体系和反应条件将试剂盒中预混液、引物和探针取出，置于冰上直至融化，将下列试剂依次加入到无RNA酶的荧光定量PCR管中。
13、采用20L反应体系，见表2所示。表 2荧光定量 PCR 反应体系试剂体积（L）2 荧光定量PCR预混液10.0上游引物(10mol/L)0.4下游引物(10mol/L)0.4探针(10mol/L)0.4cDNA1.0无RNA酶去离子水7.8总体积20.0将上述成分分别加入荧光定量PCR管中，轻轻混合均匀，瞬时离心，打开荧光定量PCR仪和联机计算机，将上述荧光定量PCR管置于荧光定量PCR仪内，设置反应程序为94 30 s，94 5 s，60 30 s，45个循环；4 终止反应。DB36/T 1747202355.2.2.4荧光定量 PCR 结果判定5.2.2.5.1试验成立的条件阈值设定原则根
14、据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。阴性对照的检测结果应无特异性扩增，阳性对照Ct值应28，则试验结果成立。5.2.2.5.2试验结果的判定判定结果按照以下要求：a)Ct 值30，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在新型鹅星状病毒，判为阳性；b)无 Ct 值，并且无扩增曲线，或者 Ct 值35，表明样品中无新型鹅星状病毒，判为阴性；c)30Ct 值35 的样品，判为可疑，必须重做，重做结果 Ct 值30 者判为阳性，否则判为阴性。5.2.3RT-LAMP 方法试验设备和试剂耗材准备见附录E。5.2.3.1病毒 RNA 的提取同5.2.1.1。5.2.3.2病毒
15、 cDNA 的合成同5.2.1.2。5.2.3.3LAMP 反应体系和反应条件配置LAMP反应液，在样品制备区加样。采用25 L反应体系，见表3所示。表 3LAMP 反应体系试剂体积（L）2buffer12.5酶混合物(EM)1.0内引物-NGoAstV-FIP1.0内引物-NGoAstV-BIP1.0外引物-NGoAstV-F30.5外引物-NGoAstV-B30.5环引物-NGoAstV-LB1.0环引物-NGoAstV-LF1.0cDNA2.0无RNA酶去离子水4.5总体积25.0将上述成分分别加入无菌的 PCR 管中，轻轻混合均匀、离心后置于 PCR 扩增仪内进行扩增，反应程序 64
16、反应 60 min，然后 85 反应 2 min 进行酶灭活处理。5.2.3.4LAMP 结果判定5.2.3.5.1试验成立条件DB36/T 174720236反应结束后，取TE染料加入产物中，混匀后在紫外线下观察。在阳性对照出现黄绿色荧光，同时阴性对照不出现黄绿色荧光的情况下，试验成立。5.2.3.5.2结果判定在紫外线下被检样品出现黄绿色荧光，判为阳性；在紫外线下被检样品未出现黄绿色荧光，判为阴性。6综合判定符合临床诊断规定的疑似病例经5.2.1、5.2.2、5.2.3中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为新型鹅星状病毒病。DB36/T 174720237AAB附录A（资料性附录）病毒分
17、离所需仪器设备和试剂耗材A.1细胞分离A.1.1仪器和设备生物安全柜、可调微量移液器（2 L-20 L、20 L-200 L、100 L-1000 L）、高压蒸汽灭菌锅、无菌离心管（1.5 mL、15 mL、50 mL）、冰箱（4、-20、-80）、漩涡振荡器、细胞培养箱、细胞培养瓶（252、752、1752）。A.1.2试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素-链霉素溶液。A.1.3分离病毒用细胞鸡肝癌细胞系（LMH），LMH培养特性见参考文献1。A.1.4培养液配制A.1.4.1细胞培养液在DMEM/F12培养液中加入10%FBS、1%青霉素
18、-链霉素溶液（1万 U/mL），用于LMH细胞培养。A.1.4.2细胞维持液在DMEM/F12培养液中加入2%FBS、1%青霉素-链霉素溶液（1万 U/mL），用于病毒感染后的LMH细胞维持。A.2鹅胚分离A.2.1仪器设备与试剂耗材可调微量移液器（2 L-20 L、20 L-200 L、100 L-1000 L）、高压蒸汽灭菌锅、无菌注射器（1mL、5 mL）、无菌剪刀、无菌镊子、无菌离心管（1.5 mL、15 mL、50 mL）、无RNA酶的带滤芯枪头、75%酒精、碘伏、冰箱（4、-20、-80）、孵化箱。DB36/T 174720238BC附录B（资料性附录）样品的采集、处理、运输及保存
19、B.1仪器设备与耗材台式高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、高压灭菌的剪刀、高压灭菌的镊子、旋涡振荡器、可调微量移液器（2 L-20 L、20 L-200 L、100 L-1000 L）、无菌注射器（1 mL、5 mL）、无RNA酶的1.5 mL离心管、无RNA酶的带滤芯枪头、0.22 m微孔滤器、冰箱（4、-20、-80）、一次性口罩、一次性手套和一次性帽子。B.2样品采集可采标NY/T 541。采集和样品前处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子，采集过程中样品不得交叉污染。样品采集过程包括以下要求：1)组织样品：采集死亡鹅或发病鹅的心、肝、肺、肾、脾等组织，采集病料时，用无菌的剪刀剪取组织样品，
20、将样品装入一次性无菌 50 mL 离心管或一次性洁净塑料自封袋，密封、编号，待检；2)细胞培养上清液：直接将细胞培养上清液加入到灭菌的 1.5 mL 离心管中，加盖、编号，待检。3)鹅胚尿囊液：直接将鹅胚尿囊液加入到灭菌的 1.5 mL 离心管中，加盖、编号，待检；4)肛拭子样品：取泄殖腔棉拭子时，将棉拭子深入泄殖腔转 3 圈并沾取少量粪便，将棉拭子头一并放入盛有 1 mL PBS 的无菌离心管中，盖上管盖并编号，10000 rpm 离心 5 min 后取上清备用。B.3样品处理B.3.1组织样品在生物安全柜内用灭菌剪刀剪碎后按照1:5加入无菌PBS（pH 7.4、0.01 molL1）进行研
21、磨，反复冻融3次后，在4 下10000 rpm 离心15 min，上清液经0.22 m滤器过滤后-80 冰箱保存。B.3.2细胞上清液和鹅胚尿囊液将细胞培养液和鹅胚尿囊液在4 下10000 rpm 离心15 min，将上清液转入灭菌的1.5 mL离心管中，依据原样品地编号。DB36/T 174720239CD附录C（资料性附录）RT-PCR 所需仪器设备和试剂耗材C.1仪器设备与耗材PCR基因扩增仪、核酸电泳仪、核酸电泳槽、凝胶成像分析系统、台式高速冷冻离心机、可调微量移液器（0.1 L-2.5 L、2 L-20 L、20 L-200 L、100 L-1000 L）、无RNA酶的1.5 mL离
22、心管、无RNA酶的PCR管、无RNA酶的带滤芯枪头。C.2试剂商品化RNA提取试剂盒、无RNA酶去离子水、反转录试剂盒（包括Buffer缓冲液、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂）、2PCR Mix、dNTPs(2.5 nmol/L each)、DNA Marker、电泳级琼脂糖、Tis-乙酸电泳缓冲液TAE(50TAE，1TAE）、1%琼脂糖、阳性对照（新型鹅星状病毒）、阴性对照（阴性尿囊液或正常细胞）。C.3引物C.3.1随机反转录引物Random 9 反转录引物。C.3.2RT-PCR引物针对鹅星状病毒的RT-PCR检测引物，参照附录F。DB36/T 1747202310DE附录D（资料
23、性附录）荧光 RT-PCR 所需仪器设备和试剂耗材D.1仪器设备与耗材台式高速冷冻离心机、实时荧光定量PCR仪、涡旋振荡器、可调微量移液器（0.1 L-2.5 L、2 L-20L、20 L-200 L、100 L-1000 L）、无RNA酶的1.5 mL离心管、无RNA酶的荧光定量PCR管、无RNA酶的带滤芯枪头。D.2试剂商品化RNA提取试剂盒、无RNA酶去离子水、反转录试剂盒（包括Buffer缓冲液、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂）、实时荧光定量PCR试剂盒、dNTPs(2.5 nmol/L each)、阳性对照（新型鹅星状病毒）、阴性对照（阴性尿囊液或正常细胞）。D.3引物D.3.1
24、特异反转录引物Random 9 反转录引物。D.3.2荧光定量RT-PCR引物和探针针对鹅星状病毒的荧光PCR引物和探针，参照附录F。DB36/T 1747202311EF附录E（资料性附录）RT-LAMP 方法所需仪器设备和试剂耗材E.1仪器设备与耗材高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分析仪、可调微量移液器（0.1 L-2.5 L、2 L-20 L、20 L-200 L、100 L-1000 L）、无RNA酶的1.5 mL离心管、无RNA酶的PCR管、无RNA酶的带滤芯枪头。E.2试剂商品化RNA提取试剂盒、无RNA酶去离子水、反转录试剂盒（包括Buffer缓冲液、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制
25、剂）、商品化LAMP 扩增试剂盒、TE 可视染料、阳性对照（新型鹅星状病毒）、阴性对照（阴性尿囊液或正常细胞）。E.3引物E.3.1随机反转录引物Random 9 反转录引物。E.3.2RT-PCR引物针对鹅星状病毒的RT-LAMP检测引物，参照附录F。DB36/T 1747202312FG附录F（资料性附录）新型鹅星状病毒 RT-PCR 引物、荧光 RT-PCR 的引物和探针、RT-LAMP 引物F.1新型鹅星状病毒RT-PCR检测引物见表F.1。表 F.1鹅星状病毒 RT-PCR 检测用引物和探针引物名称引物序列（53，上下两行分别为上下游引物序列）产物大小（bp）基因用途NGoAstV-
26、FATTCTTGGCTCGGTTGTC489ORF2RT-PCRNGoAstV-RCCTGTGTTGCTCCTTCTCF.2新型鹅星状病毒荧光RT-PCR检测用引物和探针见表F.2。表 F.2荧光 RT-PCR 检测用引物和探针引物名称引物序列（53，上下两行分别为上下游引物序列）产物大小（bp）基因用途NGoAstV-FCAATCTTTCCTGTGCATG107ORF1a荧光 RT-PCRNGoAstV-RCATTCTTGTTCTTCCAGGTGTGCTT探针引物FAM-AGCCACTAATATAGATGTCAT-TAMRAF.3RT-LAMP检测引物见表F.3。表 F.3RT-LAMP 检
27、测用引物和探针引物名称引物序列（53，上下两行分别为上下游引物序列）基因用途NGoAstV-F3GTTGAAGCAACGGTCACTTORF1bRT-LAMPNGoAstV-B3AGGTCTGCGCATTTGAAACNGoAstV-FIPTGCCGTTTTCCCTGATGCTGAA-TCGAACTATGGTCCAAAGCCNGoAstV-BIPATACCCAGGATGGTGCACTTGC-TGTGTTGCTCCTTCTCATCGNGoAstV-LFTCACTGGTCATGAGTGAGANGoAstV-LBCGCATTGCAGAGATTCCTF.4引物和探针的稀释DB36/T 1747202313开盖前，将新合成的引物或探针进行短暂离心（12000 rpm，30 s）；用DEPC处理的灭菌去离子水溶解，加水量为10总纳摩尔数（例如，合成引物或探针1 OD，5.5 nmol，则加水量为105.5=55 L）。DB36/T 1747202314参 考 文 献1 赵蕾，史爱华，李林,等.鸡肝癌细胞系LMH培养特性的研究，中国家禽，2021,43(2):116-120._
