1、 ICS 01.040.65 CCS B 00/09 34 安徽省地方标准 DB34/T 45972023 冬小麦品种抗倒春寒性评价规程 Regulations for evaluating the resistance of winter wheat varieties to late spring coldness2023-10-07 发布2023-11-07 实施安徽省市场监督管理局发 布 DB34/T 45972023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识
2、别专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽农业大学、蒙城县种植业发展中心、阜南广平种植专业合作社、安徽永民种业有限责任公司、濉溪县农业技术推广中心、淮北三丰肥业有限公司、淮北双收种业有限责任公司。本文件主要起草人：陈翔、李金才、李志敏、李明、周楠、孙建强、吴金灵、李佳佳、刘莉、圣化军、孙晓伟、汪善洋、贾训强、赵伟。DB34/T 45972023 1 冬小麦品种抗倒春寒性评价规程 1 范围 本文件规定了冬小麦品种抗倒春寒性评价的鉴定方法、倒春寒处理方法、主要指标选择和抗倒春寒性鉴定评价分级等技术内容。本文件适用于冬小麦品种抗倒春寒性的鉴定评价。2
3、规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4404.1 粮食作物种子第1部分：禾谷类 GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则 NY/T 496 肥料合理使用准则 通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 鉴定材料与方法 种子质量 4.1 供试小麦种质资源和品种的种子质量应符合 GB 4404.1 的规定。田间管理4.2 4.2.1 供试材料应在 10 月中下旬播种。选择直径 30 cm，高 35 cm 的圆柱
4、形盆，装耕层表土并施足基肥，埋于试验田中，盆内土壤与盆外大田齐平。每个参试材料种植 10 盆，每盆定苗 9 株。4.2.2 在进行小麦品种抗倒春寒性评价期间，要及时防治病、虫、草和鸟害，防止倒伏等不利情况发生。防治病虫草害农药使用应符合 GB/T 8321（所有部分）和 NY/T 496 的要求。倒春寒处理方法 4.3 4.3.1 人工模拟倒春寒处理 冬小麦生长至幼穗分化的药隔形成期（主茎倒二叶伸出、第三节间伸长）时，将盆栽移入人工气候培养室，相对湿度 70%，光照夜 0 Lx，常温对照10（CK），分别设置-4、-2、0、2、4五个低温处理，处理时间为凌晨 1:00-5:00。倒春寒处理过后
5、移回大田原位置继续生长。4.3.2 取样 DB34/T 45972023 2 倒春寒处理后采集胁迫组与对照组小麦主茎倒二叶用于指标测定与分析。5 抗倒春寒性指标检测 可溶性糖含量 5.1 利用蒽酮比色法检测分析（参见附录A）。保护酶活性 5.2 5.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 利用氯化硝基四氮唑蓝光化还原法检测分析（参见附录B）。5.2.2 过氧化物酶（POD）活性 利用邻甲氧基苯酚（愈创木酚）显色法检测分析（参见附录C）。5.2.3 过氧化氢酶（CAT）活性 利用紫外吸收法检测分析（参见附录D）。丙二醛（MDA）含量 5.3 利用硫代巴比妥酸法检测分析（参见附录E）。可孕小花数 5
6、.4 小麦开花期，取主茎穗观察记录可孕小花数（具有雄蕊、子房、柱头和柱头羽毛的小花）。产量性状 5.5 小麦收获期间，每种材料（处理和对照）考察 10 个单株主茎的穗下节间长度（cm）、小穗结实率、穗粒数（粒）、千粒重（g）等产量组分及性状。6 抗倒春寒性鉴定评价分级以可溶性糖含量、保护酶活性、可孕小花数和产量组分等指标，进行主成分分析，同时运用隶属函6.1 数值对各主成分得分值进行标准化，获得一个小麦品种响应倒春寒胁迫综合值（D），根据 D 值进行聚类分析。小麦响应倒春寒胁迫综合值（D）按照公式（1）进行计算：niWXUDiii，.321n1 (1)minmaxmin/X-XXXXUii (
7、2)niiiiPPW1/(3)式中：D小麦响应倒春寒胁迫综合值；DB34/T 45972023 3 U(Xi)通过隶属函数方法分析在主成分分析中的标准数据；Xmax每个主成分中的最大值；Xmin每个主成分中的最小值；i样本数量；Wi每个主成分中的权重系数；Pi主成分分析中每个主成分的特征值。基于 D 综合值和聚类分析图的平均隶属值结果，冬小麦抗倒春寒性等级按照表 1 进行评价。6.2 表1 冬小麦抗倒春寒性等级 D 值 抗倒春寒性等级 D0.20 弱 0.20D0.35 较弱 0.35D0.50 中等 0.50D0.65 较强 D0.65 强 DB34/T 45972023 4 附录A （资料
8、性）可溶性糖含量 将处理组和对照组叶片在 110 烘箱烘 15 min，然后调至 75 烘干至恒重。干叶片磨粉后称取50 mg 样品导入 10 mL 刻度离心管，管内加入 4 mL 80%的乙醇，置于 80 水浴中不断搅拌 40 min，离心，收集上清液，其残渣加入 2 mL 80%乙醇重复提 2 次，合并上清液。在上清液中加 10 mg 活性炭，80 脱色 30 min，80%乙醇定容至 10 mL，过滤后取滤液 1 mL，加入 5 mL 蒽酮试剂混合，在沸水中煮沸 10 min，取出后用水冷却至室温，使用紫外可见分光光度计在 625 nm 处比色，计算可溶性糖含量。按公式（A.1）计算可溶
9、性糖含量：S=（CVT）（WVt103）(A.1)式中：S可溶性糖含量（mg/g）；VT提取液体积（mL）；Vt吸取样品液体积（mL）；W样品质量（g）。DB34/T 45972023 5 附录B （资料性）超氧化物歧化酶（SOD）活性 按每克（叶片鲜重FW）小麦新鲜叶片加入 3 mL 0.05 mol/L pH 7.8 磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容至 5 mL 刻度离心管中，于 8500 r/min（10000 g）冷冻离心30 min，上清液即为SOD酶粗提液。每个处理取 8 个洗净干燥好的微烧杯并编号，按计算好的量加入各试剂及酶液，反应系统总体积为 3
10、mL。其中 4 号 8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余 7 个微烧杯均放在温度为 25。光强为 4500 Lux 的光照箱内（安装有 3 根 20 W 的日光灯管）照光 15 min。然后立即遮光终止反应。在 560 nm 波长下以 1 号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以 2、3 号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率 100%，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量在各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用
11、量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。按公式（B.1）计算超氧化物歧化酶活性：tWBVhFWgUA601000/(B.1)式中：A酶活力（酶活力单位：U/（g（FW）/h）；V酶提取液总体积（mL）；B一个酶活力单位的酶液量（L）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；1000换算系数，即1 ml=1000 L；60换算系数，即1 h=60 min。DB34/T 45972023 6 附录C （资料性）过氧化物酶（POD）活性 取处理组与对照组小麦植株叶片1g（叶片鲜重FW），剪碎置于研钵中，加 5 mL 0.1 ml/L Tris-HCl缓冲液（pH8.5），
12、研磨成匀浆，以 4000 r/min 离心 5 min，倒出上清液，必要时残渣再用 5 mL 缓冲液提取一次，合并两次上清液备用。取光径 1 cm 比色杯 2 个，向其中之一加入上述酶液 1 mL（如酶活性过高可稀释），再加入反应混合液 3 mL，立即开启秒表记录时间，于分光光度计 470 nm 波长下测量吸光值，每隔 1 min 读数一次，共测 3 min。向另一比色杯中加人 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）作为零对照。按公式（C.1）计算过氧化物酶活性：FWtVVAgUPTnm147001.0min/(C.1)式中：P过氧化物酶（POD）活性（U/（gmin）；A470nm反应
13、时间内吸光度的变化；VT粗酶提取液总体积（mL）；V1测定用粗酶液体积（mL）；FW样品鲜重（g）；0.01A470nm每下降0.01为1个酶活单位（U）；t反应时间（min）。DB34/T 45972023 7 附录D （资料性）过氧化氢酶（CAT）活性 采集处理组与对照组植株叶片 1.0 g（叶片鲜重FW）加入 pH 7.8 的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至 10 mL 刻度试管中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入刻度试管中，用同一缓冲液定容，4000 r/min，离心 15 min，上清液即为过氧化氢酶的粗酶液。分别取 3 支 10 mL 试管，其中 2 支为样品测定管（S1，S2
14、），1支为空白管（S0）（将酶液煮死），按顺序分别加入 0.2 mL 粗酶液、pH 7.8 磷酸缓冲液 1.5 mL 和蒸馏水 1.0 mL，25 预热后，逐管加入 0.3 mL 0.1 mol/L 的H2O2，每加完 1管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm 下测定吸光度，每隔 1 min 读数 1 次，共测 4 min，待 3 支管全部测定完，计算酶活性。按公式（D.1）计算过氧化氢酶活性：FWtVVAgUCTnm12401.0min/(D.1)其中：2210240SSSnmAAAA式中：C 过氧化氢酶（CAT）活性（U/（gmin）；As0加入煮死酶液的对照管吸光度；As1、A
15、s2样品管吸光度；VT粗酶提取液总体积（mL）；V1测定用粗酶液体积（mL）；FW样品鲜重（g）；0.1A240nm每下降0.1为1个酶活单位（U）；t加过氧化氢到最后一次的读数时间（min）。DB34/T 45972023 8 附录E （资料性）丙二醛（MDA）含量 采集处理组与对照组植株叶片 1.0 g（叶片鲜重FW）将其剪碎，加入 100 g/L 三氯乙酸 2 mL 和少量的石英砂，研磨；进一步加入 8 mL TCA充分研磨，匀浆液以 4000 r/min 离心 10 min，上清液即为样品提取液。吸取 2 mL 提取液，加入 2 mL 6 g/L 硫代巴比妥酸溶液，混匀后于沸水浴上反应 15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定 450 nm、532 nm 和 600 nm 波长下的吸光度。对照以 2 mL 蒸馏水代替提取液。按公式（E.1）计算丙二醛含量：M=6.45(A532-A600)0.56A450VTW.(E.1)式中：M丙二醛糖含量（umoL/g）;A450450 nm 波长下的吸光度；A532532 nm 波长下的吸光度；A600600 nm 波长下的吸光度；VT提取液体积（L）；W样品质量（g）；
