1、 ICS 67.140 CCS X 55 34 安徽省地方标准 DB34/T 42682022 发酵茶中 B 族和 G 族黄曲霉毒素的测定 Determination of aflatoxin B and G groups in fermented tea2022-08-31 发布2022-09-30 实施安徽省市场监督管理局发 布 DB34/T 42682022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农
2、村厅归口。本文件起草单位：安徽农业大学、安徽省茶业集团有限公司、肥西县农业综合服务中心、云南微生物研究所。本文件主要起草人：周育、管道健、张海柱、唐蜀昆、张梁、王希春。DB34/T 42682022 1 发酵茶中 B 族和 G 族黄曲霉毒素的测定 1 范围 本文件规定了发酵茶中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2（以下简称AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）的测定方法。本文件第一法为双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法，适用于发酵茶中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。本文件第二法为双柱净化-液相色谱柱串联质谱法，适用于发酵茶中AFB1、
3、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 5009.22 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 第一法 双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法 原理 试样中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液经多功能净化柱和免疫亲和柱净化和富集，
4、净化液经浓缩、定容和过滤后，经液相色谱分离，柱后光化学法衍生，荧光检测器检测。外标法定量。试剂及材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。4.2.1 试剂 4.2.1.1 甲醇（CH3OH，CAS：67-56-1）：色谱纯。4.2.1.2 乙腈（CH3CN，CAS：75-05-8）：色谱纯。4.2.1.3 氯化钠（NaCl，CAS：7647-14-5）。4.2.1.4 磷酸氢二钠（Na2HPO4，CAS：7558-79-4）。4.2.1.5 磷酸二氢钾（KH2PO4，CAS：7778-77-0）。4.2.1.6 氯化钾（KCl，CAS：7447-40
5、-7）。4.2.1.7 盐酸（HCl，CAS：7647-01-0）。DB34/T 42682022 2 4.2.1.8 吐温-20（C58H114O26，CAS：9005-64-5）。4.2.1.9 硫酸镁（MgSO4，CAS：7487-88-9）。4.2.1.10 聚乙烯基吡络烷酮（PVP，CAS：9003-39-8）。4.2.1.11 N-丙基乙二胺（PSA，CAS：111-39-7）。4.2.2 材料 4.2.2.1 移液管：1 mL 和 5 mL 规格。4.2.2.2 针筒式滤器：100 mL 规格，可连接于空气压力泵或手动加压。4.2.2.3 玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保
6、留 1.6 m。4.2.2.4 真菌毒素多功能净化柱（以下简称多功能净化柱）。4.2.2.5 免疫亲和柱：AFB1 柱容量 200 ng，AFB1柱回收率80%，AFG2的交叉反应率80%。4.2.2.6 一次性针式过滤器：带 0.22 m 有机相微孔滤膜。4.2.3 试剂配制 4.2.3.1 乙腈-水溶液（84+16）：取 840 mL 乙腈加入 160 mL 水，混匀。4.2.3.2 甲醇-水溶液（70+30）：取 700 mL 甲醇加入 300 mL 水，混匀。4.2.3.3 磷酸盐缓冲溶液（以下简称 PBS）：称取 8.00 g 氯化钠、1.20 g 磷酸氢二钠、0.20 g 磷酸二氢
7、钾、0.20 g 氯化钾，用 900 mL 水溶解，用盐酸调节 pH 至 7.4，用去离子水定容至 1000 mL。4.2.3.4 含 1%吐温-20 的 PBS：取 10 mL 吐温-20，用 PBS 定容至 1000 mL。4.2.4 标准品 4.2.4.1 AFB1标准品（C17H12O6，CAS：1162-65-8）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.2 AFB2标准品（C17H14O6，CAS：7220-81-7）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.3 AFG1标准品（C17H12O7，CAS：1165-39-5）：纯度
8、98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.4 AFG2标准品（C17H14O7，CAS：7241-98-7）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.5 标准溶液配制 4.2.5.1 标准储备溶液 分别称取AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2 各1 mg（精确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至 100 mL。各溶液浓度为 10 g/mL，溶液转移至试剂瓶中后，在-20 下避光保存、备用，有效期三个月。临用前，参照 GB 5009.22 进行浓度校准。4.2.5.2 混合标准工作液（AFB1和 AFG1：各 100 g/L，AFB2和 AFG2：
9、各 25 g/L)移液管准确移取AFB1和AFG1标准储备溶液各 1 mL，AFB2和AFG2标准储备溶液各 250 L 至 100 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20 下保存，一个月内有效。4.2.5.3 标准系列工作溶液稀释 DB34/T 42682022 3 准确移取混合标准工作液，按照样品检测需求，以乙腈为溶剂作适度的梯度稀释，以符合分析检测要求。仪器和设备 4.3.1 高速粉碎机。4.3.2 涡旋振荡器或摇床。4.3.3 天平：感量 0.01 g 和 0.00001 g。4.3.4 涡旋混合器。4.3.5 离心机：转速 6000 g。4.3.6 固相萃取装置：配 15 mL-5
10、0 mL 免疫亲和层析针筒。4.3.7 空气压力泵。4.3.8 氮吹仪。4.3.9 液相色谱仪：配荧光检测器。4.3.10 液相色谱柱。4.3.11 黄曲霉毒素光化学柱后衍生器。4.3.12 筛网:1 mm2 mm 试验筛孔径。分析步骤 4.4.1 取样 4.4.1.1 茶汤 采样量需大于 1 L，将所有液体样品在一个容器中混匀后，取其中任意的 100 mL 样品，供检测用。4.4.1.2 干茶 采样量需大于 1.0 kg，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于 2 mm，混合均匀后，以四分法缩分至 100 g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。4.4.2 提取 4.4.2.1 茶汤 取
11、50 mL 试样（精确至 0.01 mL），然后加入 50 mL 乙腈（精确至 0.01 mL），7.5 g 氯化钠（精确至 0.01g），涡旋 1 min，6000 g 离心 10 min，取上清液，再加入 50 mL 乙腈重复提取，然后合并两次上清液，并加入 2 g 氯化钠（精确至 0.01 g），2 g 硫酸镁（精确至 0.01 g），5 g PVP（精确至0.01 g），2 g PSA（精确至0.01 g），6000 g 离心 10 min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。4.4.2.2 干茶 称取 5 g 试样（精确至 0.01g）于 50 mL 离心管中，加入 25 mL
12、乙腈-水溶液（4.2.3.1）或甲醇-水溶液（4.2.3.2），涡旋混匀，置于涡旋振荡器或摇床中振荡 20 min，将茶叶及取提液全部转移至针筒式滤器，真空抽滤（或手动加压过滤）。收集全部提取液于离心管中，在 6000 g 下离心 10 min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。4.4.3 净化 DB34/T 42682022 4 4.4.3.1 多功能净化柱净化 移取适量上清液，按多功能净化柱的操作说明进行净化，收集全部净化液，并确保净化液多于 4 mL。4.4.3.2 免疫亲和柱净化 4.4.3.2.1 上样液的准备 用刻度移液管准确吸取上步的净化液 4 mL（茶汤样品 20 mL
13、或依据浓度适当调整），加入 46 mL 含 1%吐温-20 的PBS（使用甲醇-水溶液作为黄曲霉毒素提取溶剂时，加入含 1%吐温-20 的PBS可减半加入），混匀。4.4.3.2.2 免疫亲和柱准备 将 2 6 条件下保存的免疫亲和柱从冷藏条件下取出，恢复至室温连接于固相萃取装置。4.4.3.2.3 亲和层析净化 待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液（4.4.3.2.1）移至 50 mL 注射器筒中（或按照批次分批次移入 10 mL-20 mL 注射器筒），调节下滴速度，控制样液以每秒一滴的速度稳定流过免疫亲和柱。样液流完后，向注射器筒内加入 10 mL 含 1%吐温-20 的PBS，以每
14、秒 2 滴的流速淋洗免疫亲和柱，并重复一次净化步骤。待清洗液流完后，用空气压力泵吹干免疫亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置 5 mL 刻度试管，加入 2 mL 甲醇，以每秒1滴的速度洗脱免疫亲和柱，再用空气压力泵吹干免疫亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在 50 条件下，用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入 1.0 mL 甲醇-水溶液（45:55，V/V），涡旋 30 秒溶解残留物，过 0.22 m 有机滤膜过滤，收集滤液待测。4.4.4 液相色谱参考条件 高效液相色谱参考条件如下：a)流动相：A 相：水；B 相：甲醇；b)等梯度洗脱条件：A 相：55%；B 相：45%；c)色谱柱：C18柱（
15、柱长 250 mm 或 150 mm，柱内径 4.6 mm，填料粒径 5 m)，或相当者；d)流速：0.8 mL/min；e)柱温：40；f)进样量：10 L；g)光化学柱后衍生器；h)激发波长：360 nm；发射波长：440 nm；i)液相色谱图参见附录 A。4.4.5 定性检测 试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准品色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在 2.5%之内。4.4.6 标准曲线制作 DB34/T 42682022 5 在4.4.4的液相色谱分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2色谱峰面积与各对应浓度作图，得到标准曲线回归方程
16、，其线性相关系数应大于 0.99。4.4.7 空白试验 称取不含黄曲霉毒素的空白试样，按照上述同样的提取、净化和检测步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。分析结果计算与表述 试样中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量，用上述外标法的标准曲线，以待测样品目标毒素的峰面积，按照公式（1）计算出毒素浓度，计算结果保留三位有效数字，单位为（g/kg 或 g/L）。=1000(0)1000 (1)式中：C 试样中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，单位为微克每千克或微克每升（g/kg或g/L）；标准工作液中黄曲霉毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A 样液中黄曲霉毒素
17、的峰面积；A0 空白样液中黄曲霉毒素的峰面积；V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 最终样液所代表的试样量，单位为克或毫升（g或mL）；AS 标准工作液中黄曲霉毒素的峰面积。精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值，不得超过算术平均值的 20%。检测限 当称取样品 5 g（或50 mL）时，AFB1的检出限为 0.04 g/kg（或g/L），AFB2的检出限为 0.02 g/kg（或g/L），AFG1的检出限为 0.04 g/kg（或g/L），AFG2的检出限为 0.02 g/kg（或g/L）。5 第二法 双柱净化-液相色谱柱串联质谱检测法 原理 试样中的AFB1、AF
18、B2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含 1%吐温-20 的磷酸盐缓冲溶液稀释后，经黄曲霉毒素多功能净化柱初步净化，再用免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后，经液相色谱分离，串联质谱检测。外标法定量。试剂和材料 5.2.1 试剂 同4.2.1。5.2.2 材料 同4.2.2。DB34/T 42682022 6 5.2.3 试剂配制 同4.2.3。5.2.4 标准品 同4.2.4。5.2.5 标准溶液配制 同4.2.5。仪器和设备 5.3.1 高速粉碎机。5.3.2 涡旋振荡器或摇床。5.3.3 天平：感量 0.01 g 和 0.00001 g。5.3.4
19、 涡旋混合器。5.3.5 空气压力泵。5.3.6 离心机：转速6000 g。5.3.7 固相萃取装置：配 15 mL50 mL 免疫亲和层析针筒。5.3.8 氮吹仪。5.3.9 筛网：1 mm 2 mm 试验筛孔径。5.3.10 液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。分析步骤 5.4.1 取样 同4.4.1。5.4.2 提取 同4.4.2。5.4.3 净化 同4.4.3。5.4.4 液相色谱参考条件 高效液相色谱参考条件如下：a)流动相：A 相：水；B 相：甲醇；b)梯度洗脱：95%A 相（0 min5 min），95%35%A 相（5 min7.5 min），95%A 相（7.5 min10
20、 min）；c)色谱柱：C18柱（柱长 100 mm，柱内径 2.1 mm；填料粒径 1.7 m），或相当者；d)流速：0.4 mL/min；e)柱温：25；f)进样体积：1.0 L。5.4.5 质谱参考条件 DB34/T 42682022 7 质谱参考条件列出如下：a)检测方式：多离子反应监测（MRM）；b)离子源控制条件：电离方式，ESI；毛细管电压，1.5 kV；碰撞能量，6 eV；锥孔电压，40 V；离子源温度，120；锥孔反吹气流量，50 L/h；脱溶剂气温度，500；脱溶剂气流量，900 L/h；电子倍增电压 650 V；c)离子选择参数：离子化方式，ESI+M+H+；AFB1，母
21、离子 313/定量离子 241，定性离子 269；AFB2，母离子 315/定量离子 259，定性离子 287；AFG1，母离子 329/定量离子 243，定性离子215；AFG2，母离子 331/定量离子 285，定性离子 245；d)总离子流图：参见附录 B；e)子母离子扫描图：参见附录 C。5.4.6 定性检测 5.4.6.1 试样中各目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5%之内。5.4.6.2 每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子；同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶
22、液相比，其允许偏差不超过规定的范围（相对离子丰度 50%，允许相对偏差 20%；相对离子丰度 20%50%，允许相对偏差 25%；相对离子丰度 10%20%，允许相对偏差 30%；相对离子丰度 10%，允许相对偏差50%）。5.4.7 标准曲线制作 在5.4.4和5.4.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2色谱峰面积与各对应浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。5.4.8 试样溶液的测定及浓度范围调整 取5.4.3中净化得到的待测溶液进样，按照5.5公式计算样品中各待测物含量。待测样液中的响应值应
23、在标准曲线线性范围内，若超过线性范围则应进行适当稀释提取液或减少取样量重新测定。5.4.9 空白试验 称取不含黄曲霉毒素的试样，按照上述5.4.15.4.8同样的提取、净化和检测步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。分析结果计算与表述 试样中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量，用上述外标法标准曲线确认线性范围，以待测样品目标毒素的峰面积，按照公式（2）计算出毒素浓度，计算结果保留三位有效数字，单位为（g/kg或g/L）。=1000(0)1000 (2)式中：C 试样中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，单位为微克每千克或微克每升（g/kg或g/L）；标准工作液中黄曲
24、霉毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A 样液中黄曲霉毒素的峰面积；A0 空白样液中黄曲霉毒素的峰面积；DB34/T 42682022 8 V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 最终样液所代表的试样量，单位为克或毫升（g或mL）；AS 标准工作液中黄曲霉毒素的峰面积。精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20%。检测限 当称取样品 5g（或 50 mL）时，AFB1的检出限为 0.02 g/kg（或g/L），AFB2的检出限为 0.05 g/kg（或g/L），AFG1的检出限为 0.1 g/kg（或g/L），AFG2的检出限为 0.21
25、g/kg（或g/L）。DB34/T 42682022 9 A A 附录A （资料性）黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2液相色谱图 A1为四种黄曲霉毒素添加回收样品色谱峰；A2为四种黄曲霉毒素标准品色谱峰。图A.1 黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2液相色谱图 DB34/T 42682022 10 B B 附录B （资料性）黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2总离子流扫描图 B1为AFB1总离子峰；B2为AFB2总离子峰；B3为AFG1总离子峰；B4为AFG2总离子峰。图B.1 黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2总离子流扫描图 DB34/T 42682022 11 C C 附录C （资料性）黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2字母离子扫描图 C1为AFB1母离子扫描图；C1-1为AFB1子离子扫描图；C2为AFB2母离子扫描图；C2-2为AFB2子离子扫描图；C3为AFG1母离子扫描图；C3-3为AFG1子离子扫描图；C4为AFG2母离子扫描图；C4-4为AFG2子离子扫描图。图C.1 黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2子母离子扫描图
