1、!7,江苏省市场监督管理局发 布中 国 标 准 出 版 社出 版淡水生物环境 DNA 监测技术方法Technical method for environmental DNA monitoring of freshwater organisms20230922 发布20231022 实施CCS Z 06DB32/T 45392023ICS 13.020DB32/T 45392023前言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 监测点位布设 35 监测频次与时间 46 试剂和材料 47 仪器和设备 58 环境 DNA 宏条形码监测内容和方法59 质量控制与质量保证 910 废弃物
2、处理 10附录 A（资料性）环境 DNA 固定剂11附录 B（资料性）常用淡水生物 DNA 条形码扩增引物信息12附录 C（规范性）淡水生物 DNA 条形码构建方法14附录 D（资料性）生物统计表 17附录 E（规范性）野外质量控制与保证 18附录 F（规范性）实验室质量控制与保证 19参考文献 21目 次DB32/T 45392023前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省生态环境厅提出并归口。本文件起草单位：江苏省环境监测中心、南京大学
3、。本文件主要起草人：张咏、张效伟、杨雅楠、杨江华、蔡琨、王晨波、吕学研、李婧慧、张丽娟、钟文军、侍昊、朱晨、毛成责、卜亚谦、范帆。DB32/T 45392023淡水生物环境 DNA 监测技术方法1范围本文件规定了利用环境 DNA 技术监测淡水生物的采样、试剂和材料、仪器和设备、监测内容和步骤，以及质量控制与保证。本文件适用于生态环境监测领域湖泊、水库、溪流、河流、河口区等水域浮游植物、浮游动物、着生藻类、大型底栖无脊椎动物和鱼类等淡水生物物种组成及相对丰度的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文
4、件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 20001.4 标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准GB/T 29859 生物信息学术语GB/T 30989 高通量基因测序技术规程GB/T 34265 Sanger 法测序技术指南GB/T 35890 高通量测序数据序列格式规范GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则GB/T 40226 环境微生物宏基因组检测 高通量测序法HJ 91.2 地表水环境质量监测技术规范HJ 494 水质 采样技术指导HJ 710.7 生物多样性观测技术导则 内陆水域鱼类HJ 710.
5、8 生物多样性观测技术导则 淡水底栖大型无脊椎动物HJ 1216 水质 浮游植物的测定 0.1 ml 计数框显微镜计数法HJ 1295 水生态监测技术指南 河流水生生物监测与评价（试行）HJ 1296 水生态监测技术指南 湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）SC/T 9402 淡水浮游生物调查技术规范SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求DB 21/T 2777 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程DB 32/T 4178 河流水生态监测规范3术语和定义GB/T 20001.4、GB/T 29859 和 GB/T 30989 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1淡水生物freshwat
6、er organisms生活在各类淡水生境中的生物。1DB32/T 45392023注：主要的淡水生物类群包括浮游植物、浮游动物、大型底栖无脊椎动物和鱼类等。3.2环境 DNA environmental DNA；eDNA环境介质（水、土壤、沉积物、生物膜、空气等）或混合生物组织中存在的脱氧核糖核酸（DNA）等生物遗传物质。3.3DNA 条形码DNA barcode生物体细胞核或者细胞器中能够代表该物种的、有足够变异的、易扩增的短 DNA 序列，可用于物种的识别和鉴定。来源：SN/T 42782015，3.1，有修改3.4引物primer在 DNA 复制过程中，结合于模板链上并提供 DNA 合
7、成起点，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。3.5聚合酶链式反应polymerase chain reaction；PCR一种体外酶促合成特异 DNA 片段的分子技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等组成一个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。3.6Sanger 测序Sanger sequencing用于基因测序的双脱氧末端终止法，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以A/T/G/C 结束的四组不同长度的核苷酸链，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。3.7遗传距离genetic distance群或分类单元间的遗传差异程
8、度，可以通过遗传标记如 DNA 条形码的序列差异来表示。3.8高通量测序highthroughput sequencing区别于传统 Sanger（双脱氧链末端终止法）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。来源：GB/T 309892014，3.19，有修改3.916S 核糖体DNA 16S ribosomal DNA；16S rDNA原核生物编码核糖体小亚基 rRNA 的 DNA 序列。3.1018S 核糖体DNA 18S ribosomal DNA；18S rDNA真核生物编码核糖体小亚基 rRNA 的 DNA 序列。3.11线粒体 12S 核糖体 DNA mitocho
9、ndrial 12S ribosomal DNA；Mt 12S rDNA后生动物线粒体编码 12S rRNA 的 DNA 序列。3.12线粒体细胞色素 c 氧化酶 I mitochondrial cytochrome c oxidase I；COI后生动物线粒体编码细胞色素 c 氧化酶 I 的 DNA 序列。3.13DNA 宏条形码DNA metabarcoding利用高通量测序获取环境 DNA 中特定的 DNA 片段，根据 DNA 序列差异识别物种，获取物种组成2DB32/T 45392023和群落结构。3.14标签tag通过 PCR 或文库准备过程中为每个样品添加一个短序列的核苷酸碱基对，
10、允许多个样品在一个高通量测序运行中被汇集。注：这个序列对于同一个运行中的每个样本都是不同的，并使序列能够在测序后分配回它们来自的样本。3.15序列相似性sequence similarity反映序列间相似程度的数值，即序列间相同 DNA 碱基数目所占的比例。注：一般以百分数表示。来源：SN/T 42782015，3.8，有修改3.16序列相似性阈值cutoff value of sequence similarity判定两条 DNA 序列是否为同一分类单元的最小序列相似值。3.17扩增序列变体amplicon sequence variants；ASVDNA 宏条形码技术中，通过生物信息学剔除
11、 PCR 扩增和测序产生的错误序列后形成的独特 DNA序列，即任意两条序列间至少有一个碱基存在差异。3.18操作分类单元operational taxonomic unit；OTUDNA 宏条形码测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平分类单元。3.19相对丰度relative abundance样品中分配到某一分类单元的序列数占该样品序列总数的比例。来源：GB/T 402262021，3.2，有修改3.20阴性质控样本negative control sample确定不含特定物种或者所有物种的样本（例如无菌水），与待测样本同步试验，用于判断待测样本是否被污染。3
12、.21阳性质控样本positive control sample已确定物种组成的样本，与待测样本同步试验，用于判断测序结果是否可靠。4监测点位布设4.1通则按照 HJ 91.2 设置环境 DNA 采样点位，应遵循连续性、一致性、代表性和可行性原则。结合环境DNA 的时空分布特征，综合考虑监测类群的生态和生活史特征、水体类型、大小、深度、分层、连通性、基质、温度、水文和水化学等因素的影响。注：生活污水中可能含有残留的生物 DNA，采样位点布设要尽量避免污水排放渠和污水处理厂，并详实记录。3DB32/T 453920234.2溪流、河流点位布设按照 HJ 1295 的规定设置监测断面，每个断面设置
13、不少于 3 个代表性点位。在缓慢流动的低地溪流和河流中，宜间隔 1 km 设置采样点。在快速流动的高山溪流和河流中，采样位点宜间隔 10 km 以上。应详实记录河流的地形特征（如地形、河岸结构、河床沉积物、人工改造等）、流速、水温、pH 值等影响环境DNA 扩散的因素。4.3湖泊、水库监测点位布设按照 HJ 1296 的规定设置监测点位，大型湖泊应适当增加监测点位。湖库构成湖库群，当对区域湖库作整体监测时，可适当减少单个湖库的监测点位。宜设置湖库监测点位周边 100 m 的范围内为采样区域。深水型湖泊宜间隔 5 m 深度分层采样。5监测频次与时间5.1监测频次综合考虑水域环境条件、生物类群的时
14、空分布特点、监测目的及人力、费用投入，确定监测频次。可选择季度或月度开展监测，应避开雨水集中的时间。针对重点关注区域、突发环境问题或其他条件下，可开展更高频次的监测。5.2监测时间采样时间宜综合考虑靶向监测类群的生态特征和生活史及水体类型。例如：湖泊、水库，宜考虑生物类群的季节性分层；溪流、河流，宜考虑迁移物种的分布模式（如鱼类洄游）。6试剂和材料6.1超纯水。6.2分析纯无水乙醇。6.3环境 DNA 固定剂，可参考附录 A。6.4DNA 提取试剂盒或 CTAB 法提取 DNA 所用到的试剂。6.5PCR 扩增试剂：用于特异性片段 PCR 扩增，通常包含缓冲液、扩增酶等。6.6PCR 扩增引物
15、：可参考附录 B。6.7PCR 产物纯化试剂盒：用于 PCR 产物纯化。6.8DNA 浓度测定试剂：用于 DNA 浓度测定，主要成分包括缓冲液和染色剂。6.9凝胶电泳相关试剂：用于 PCR 产物凝胶电泳检测，通常包含琼脂糖、电泳缓冲液（TAE）、片段大小标记。6.10文库构建试剂：用于样品的基因文库构建，试剂盒内至少应包含末端修复酶、测序接头、DNA 连接酶、缓冲液。6.11高通量测序试剂：用于对测序文库进行高通量基因测序，试剂盒内至少应包含测序引物、测序反应酶、缓冲液。6.12无菌采样瓶或采样袋：1 L 及以上规格。6.13无菌微孔滤膜：0.22 m、0.45 m、1.2 m 和 5 m 等
16、。6.14无菌镊子。4DB32/T 453920236.15无菌离心管：1.5 mL、2 mL、10 mL，无 DNA 和生物残留。6.16冻存管：5 mL，无 DNA 和生物残留。6.17枪头：10 L、200 L、1 000 L 和 5 mL 等，无 DNA 和生物残留。6.18PCR 管、96 孔板等类似的 PCR 反应容器：无 DNA 和生物残留。6.19无菌手套。7仪器和设备7.1恒温水浴锅。7.2涡旋振荡器或均质仪。7.3冷冻干燥仪。7.4真空离心浓缩仪。7.5高速冷冻离心机：离心转速可达 13 000 r/min，温控范围低至 4。7.6微量移液器：0.5 L10 L、20 L2
17、00 L 和 100 L1 000 L 等。7.7超微量分光光度计：测量体积最小 1 L，波长范围包括 230 nm、260 nm 和 280 nm。7.8PCR 仪。7.9电子天平。7.10水平式核酸电泳仪。7.11凝胶成像分析仪。7.12高通量测序仪。7.13高温高压灭菌器：可达到标准要求的 121、21 min 灭菌条件。7.14采水器：2 L 或 5 L。7.15浮游生物网：25 号浮游动物网，孔径 64 m。7.16着生藻类采集器具：毛刷、刀片、托盘、洗瓶等。7.17大型底栖无脊椎动物采集装置：如彼得森采泥器、D 型抄网、踢网、索伯网等。7.18水样抽滤设备：具备-91.2 kPa
18、以上的真空抽滤设备。7.19大型底栖无脊椎动物清洗装置：如 40 目筛网等。7.20超净工作台。7.21低温存储设备：普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱。7.22液氮罐。7.23工作站：运行内存不低于 16 GB，硬盘存储不低于 1 TB，处理器不低于 8 核。7.24高通量测序数据质量控制和分析软件。8环境 DNA 宏条形码监测内容和方法8.1环境 DNA 宏条形码监测内容环境 DNA 宏条形码监测包括环境 DNA 样品采集、环境 DNA 提取、宏条形码扩增与测序、生物信息学分析、生物统计表和质量控制与质量保证等过程（见图 1）。5DB32/T 45392023图 1 环境 DNA 宏条形码监测
19、技术流程8.2环境 DNA 样品采集8.2.1通则根据监测的生物类群，按照表 1 选择合适的环境 DNA 采集方法，每个位点采集 3 个生物重复样品。表 1 不同生物类群的环境 DNA 采样介质生物类群浮游植物着生藻类浮游动物大型底栖无脊椎动物鱼类 注：+表示可用，+表示较多采用，+表示最为常用。a 浮游动物主要通过浮游生物网收集组织 DNA。b 大型底栖无脊椎动物主要通过采集沉积物中底栖动物组织，进一步通过乙醇浸提法获取组织 DNA。水样+沉积物+生物膜+混合生物组织+a+b8.2.2水样水样采集按照 HJ 494 的规定执行，采样体积不宜小于 1 L。浮游植物监测的水样体积宜为 1 L，底
20、栖动物和鱼类监测的水样体积宜为 3 L。现场过滤至一定孔径（一般为 0.45 m）的滤膜上，高泥沙水样，应低温（4 或冰袋保存）静置分离悬浮颗粒物，再过滤。生物密度较高的水体（如处于藻华爆发期），可将水样等体积分开过滤至多张（15）滤膜作为子样本。野外干冰、液氮或-20 保存，实验室-20 以下保存；或者加入附录 A 推荐的固定剂，常温保存。8.2.3沉积物样品按照 HJ 494 的规定采集 50 mL 的表层沉积物（0 cm5 cm），剔除砾石、木屑、杂草、贝壳及其他大体积生物残体，收集至无菌管中，同一采样点沉积物采集宜涵盖各类小生境（如沉水植被覆盖区等）。野外干冰或-20 保存，实验室-2
21、0 保存；或者加入无水乙醇，确保样品中最终的乙醇浓度80%，低温6DB32/T 45392023保存。8.2.4生物膜样品按照 DB32/T 4178 的规定从不同自然基质（如粗砾石、鹅卵石以及树木残干等）表面刮取 25 cm2 样品，无菌水清洗至采样瓶中，野外干冰或-20 保存，实验室-20 保存；或者加入无水乙醇，确保最终的乙醇体积分数80%，低温保存。8.2.5混合生物组织样品8.2.5.1按照 SC/T 9402 的规定用浮游生物网定量采集浮游动物样品，采样体积不小于 20 L，过滤至5 m 孔径滤膜，野外干冰保存，实验室-20 保存；或者加入附录 A 推荐的固定剂，常温保存。8.2.
22、5.2大型底栖无脊椎动物采集与筛选应按照 HJ 710.8，加入 3 倍体积的无水乙醇，1 g 换算为 1 mL，常温保存。8.3环境 DNA 样品前处理8.3.1滤膜样品（水样/混合浮游动物组织样品）：利用研磨珠和裂解液将滤膜振荡破碎。8.3.2沉积物样品：乙醇保存的样品应高速（不低于 12 000 r/min）离心 20 min，留取沉淀物。低温保存的样品可经均质仪均质后冷冻干燥，充分混匀。8.3.3生物膜样品：4 解冻，振荡混匀，取 2 mL 样品，高速（不低于 12 000 r/min）离心 20 min，留取沉淀物。8.3.4混合底栖动物组织样品：室温放置 5 d，多次振荡混匀，吸取
23、浸出液，真空离心浓缩至乙醇完全去除。8.4环境 DNA 提取8.4.1DNA 提取按照 GB/T 40226 中的操作步骤，借助物理和化学方法充分释放环境介质中蕴含的 DNA，并去除样品中的蛋白质、脂类、多糖、RNA 等杂质，采用离心柱法和磁珠法等常规分子生物学操作纯化 DNA。8.4.2DNA 浓度测定与保存样本 DNA 质量浓度应不低于 1 ng/L，最佳质量浓度范围为 10 ng/L100 ng/L，260 nm 和 280 nm波长处的吸光度值比值（OD260 nm/OD280 nm）应在 1.72.0 范围内，OD260 nm/OD230 nm 应大于 2.0。DNA 平行分装后，应
24、在20 及以下温度条件保存，避免反复冻融。8.5宏条形码扩增与测序8.5.1宏条形码扩增8.5.1.1针对不同生物类群选择特异性一对或多对引物扩增目标条形码序列，可在引物序列前添加标签以区分样品。推荐引物参照附录 B。8.5.1.2宏条形码产物用 1%2%的琼脂糖凝胶电泳检测，应呈现单一清晰明亮、无拖尾的条带。若样品出现多个条带，需纯化 PCR 产物，纯化过程参考 SN/T 4278。8.5.1.3条形码扩增产物在-20 及以下保存，保存时间一般不超过 1 年。7DB32/T 453920238.5.2高通量测序8.5.2.1宜将含有不同的引物标签的宏条形码扩增产物等摩尔量混合构建测序文库。文
25、库构建起始量应不低于 100 ng。当文库的片段长度分布符合预期，且文库浓度满足高通量测序要求时，文库质检合格。8.5.2.2将多个质检合格的文库按比例混合，参考 GB/T 30989 和 GB/T 35537 对宏条形码扩增产物进行测序。同一试验样本宜安排在同一批次上机测序。每个样本的预期的有效序列数不宜低于 30 000 条。8.6生物信息学分析8.6.1一般要求同一批试验数据，生物信息学分析流程及关键参数应保持一致。8.6.2序列质量控制双端测序应进行序列合并。通过搜索特定序列（去除测序接头 adaptor、样品标签 tag 和引物），并基于碱基识别质量（Q20，参考）和序列长度（预期长
26、度的 70%，参考）进行序列修剪，确保前端序列长度+后端序列长度两段序列的重叠长度（overlap）目标序列长度。8.6.3文库拆分根据每个样品的标签将序列分配到不同的样品中。8.6.4序列聚类及质量控制8.6.4.1可选用 OTU 或 ASV 方法进行序列聚类和或降噪，获得分子分类单元，并过滤掉非目标序列。8.6.4.2OTU 方法：将相似性大于或等于阈值（相似性阈值一般为 97%）的序列合并成 OTUs，将序列比对到每个 OTU 的代表性序列，获得每个 OTU 在每个样品中出现的序列数。8.6.4.3ASV 方法：每个独特的序列即为一个 ASV，根据生物信息学方法过滤潜在的 PCR 和测序
27、错误的 ASV 序列，将序列比对到每个 ASV，获得每个 ASV 在每个样品中出现的序列数。8.6.5过滤低丰度的分子分类单元过滤低丰度（如总序列数为 15，可能为假阳性、污染序列或未去除的嵌合体）和阴性对照中相对序列丰度超过千分之一的分子分类单元，也可根据实际监测需求调整过滤的丰度阈值。注：嵌合体为 PCR 扩增中产生的由两种或两种以上序列母体组合的错误序列。8.6.6物种注释将分子分类单元的序列与条形码数据库比对分析，获得物种注释信息。物种注释方法和物种鉴定阈值（主要是序列相似性）的选择，宜综合考虑选用的条形码片段、参考数据库的完整性及数据用途。当参考数据库中不存在目标物种的 DNA 序列
28、时，按照附录 C 构建 DNA 条形码。8.7结果统计8.7.1检出判定分子分类单元在某一位点的生物重复样品中检出率（物种检出的样品数除以总样品数）不应低于2/3。建议每个样品宜保留相对丰度0.01%，出现在两个样点以上的分子分类单元。8DB32/T 453920238.7.2序列相对丰度每个位点检出的分子分类单元的序列相对丰度应为所有生物重复样品中序列相对丰度的平均值。针对相对丰度差异较大的生物重复，宜取几何平均数。8.7.3生物统计表每个样品的生物多样性统计表由分子分类单元（如 ASVs 或 OTUs）名称、序列、物种注释信息、序列数和相对丰度组成，可参考附录 D。9质量控制与质量保证9.
29、1质量控制9.1.1质量控制参数9.1.1.1阴性对照在每天的样品采集、同一批次 DNA 提取和 PCR 扩增阶段应分别设置不少于 3 个阴性对照，高通量测序时可适当设置 13 个测序的阴性对照（见表 2）。表 2 环境 DNA 宏条形码技术每个流程设置的阴性和阳性对照操作过程过滤DNA 提取PCR 扩增测序阴性质控样本无菌水无菌水无菌水无菌水阳性质控样本无已知组成的混合群落已知物种组成的 DNA 标准样品测序试剂盒中的对照试剂9.1.1.2阳性对照宜设置不少于 6 个 PCR 扩增的阳性对照。PCR 扩增的阳性对照应为不少于 5 个物种的基因组DNA（已知可以有效扩增）的等量混合物，质量浓度
30、一般为 1 ng/L。也可根据试验需要和试验条件在DNA 提取和测序过程中适当设置阳性对照（见表 2）。9.1.1.3平行样品每个位点应设置至少 3 个生物重复样品，可根据试验需求和试验条件适当设置 DNA 提取、PCR 和建库测序平行样品。平行样品的相对丰度取平均值作为位点的相对丰度。9.1.2质量控制评价指标9.1.2.1假阴性率使用 PCR 扩增的阳性对照评估监测的假阴性率。重复测定 6 次，计算标准样品中含有但测量结果中未检出的物种所占比例，即假阴性率（FN）。假阴性率不应超过 10%。按照公式（1）计算。FN=n1 n（1）式中：FN假阴性率；9DB32/T 45392023n1 标
31、准样品中未被测出的物种数目，单位为个；n标准样品的实际物种数目，单位为个。9.1.2.2假阳性率使用 PCR 扩增的阳性对照评估监测的假阳性率。重复测定 6 次，计算测量结果的中标准样品中未包含物种的出现概率，即假阳性率（FP）。假阳性率不应超过 10%。按照公式（2）计算。FP=n2 n（1）式中：FP假阳性率；n2 未在标准样品物种清单的物种数目，单位为个；n标准样品的实际物种数目，单位为个。9.2质量保证9.2.1野外质量保证按照附录 E 的规定做好野外样品采集、运输与保存，防止样品的交叉污染。9.2.2实验室质量保证试验过程应防止样品的污染，并按照附录 F 的规定做好数据记录和样品保存
32、。10废弃物处理废弃物的分类、收集、存放和集中处理应按照 GB 19489 和 SN/T 4835 的规定执行，其中生物废弃物在处理之前应采用高压灭菌、消毒或灼烧等方式灭活，对含核酸染料的废液和废胶单独收集和处理。10DB32/T 45392023附录A（资料性）环境 DNA 固定剂A.1乙醇固定剂乙醇的体积分数不小于 96%，且其中不含甲醇等其他醇类。固定剂需浸没整个样本，样本在乙醇中可以在常温下稳定储存 3 个月6 个月。乙醇保存样本不可在10 以下储存。A.2Longmires 固定剂Longmires 固定剂应浸没整个样本。常温下，样本在 Longmires 中可以稳定储存 2 周6
33、周。Longmires 固定剂在低温下可能会出现沉淀，可适当加热待沉淀溶解再使用。Longmires 固定剂配方见表 A.1。表 A.1 Longmires 固定剂配方序号1234定容成分TrisHClEDTANaClSDS双蒸水浓度1 mol/L0.5 mol/L4 mol/L体积100 mL200 mL2.5 mL5 g1 L11DB32/T 45392023附录B（资料性）常用淡水生物 DNA 条形码扩增引物信息常用淡水生物 DNA 条形码扩增引物信息如表 B.1 所列。表 B.1 常用淡水生物 DNA 条形码扩增引物信息蓝藻门真核藻类着生硅藻浮游动物大型底栖无脊椎动物大型底栖无脊椎动物
34、鱼类16S_V316S_V416S_V3_V423S18S_V918S_V418S_V4COI1COI2Mt 12S rDNA1Mt 12S rDNA2Mt 12S rDNA316S_341F16S_518R16S_515F16S_806R16S_338F16S_806Rp23SrV_f1p23SrV_r118S_1389F18S_1510RTAReuk454FWD1TAReukREV3DIV4_FDIV4_RmlCOIintFdgHCO2198mlCOIintFjgHCO2198MetafishF1MetafishR1Teleo_FTeleo_RTele02_FTele02_RACCTACG
35、GGRSGCWGCAGATTACCGCGGCTGCTGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAAGGACTACHVGGGTWTCTAATACTCCTACGGGAGGCAGCAGGGACTACHVGGGTWTCTAATGGACAGAAAGACCCTATGAATCAGCCTGTTATCCCTAGAGTCCCTGCCHTTTGTACACACCCTTCYGCAGGTTCACCTACCCAGCASCYGCGGTAATTCCACTTTCGTTCTTGATYRAGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCTCTGACAATGGAATACGAATAGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCCTAAAC
36、TTCAGGGTGACCAAAAAATCAGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCCTAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCATCGTGCCAGCCACCGCGGTTAATAGTGGGGTATCTAATCCCAGACACCGCCCGTCACTCTCTTCCGGTACACTTACCATGAAACTCGTGCCAGCCACCGGGTATCTAATCCCAGTTTG100200300400500400450100200300400400500313313150200100150200556255625562495255625562485545554555606355605560目
37、标群落基因名称引物名称引物序列（53）预期长度bp退火温度12DB32/T 45392023Mt 12S rDNA4Mt 16S rDNAMifish_U_FMifish_U_RFish16S_FFish16S_RGTCGGTAAAACTCGTGCCAGCCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGTCGCCCCAACCRAAGCGAGAAGACCCTWTGGAGCTTIAG15020010055605560鱼类表 B.1 常用淡水生物 DNA 条形码扩增引物信息（续）目标群落基因名称引物名称引物序列（53）预期长度bp退火温度简并碱基代码：M：（A/C）、V：（A/C/G）、R
38、：（A/G）、H：（A/C/T）、W：（A/T）、D：（A/G/T）、S：（C/G）、B：（C/G/T）、Y：（C/T）、N：（A/G/C/T）、K：（G/T）。13DB32/T 45392023附录C（规范性）淡水生物 DNA 条形码构建方法C.1DNA 条形码构建流程当参考数据库中不存在目标物种的 DNA 序列时，按照本附录构建 DNA 条形码。水生生物 DNA 条形码构建流程主要包括物种鉴定、条形码扩增与测序、条形码评估和条形码入库等过程。C.2样品采集和物种鉴定C.2.1浮游植物的定性样品采集、保存与鉴定应按照 HJ 1216 的规定执行，浮游植物的分离培养按照DB21/T 2777
39、的规定执行。C.2.2浮游动物的定性样品采集与鉴定应按照 SC/T 9402 的规定执行，加乙醇溶液固定（乙醇体积分数90%），常温保存。C.2.3大型底栖无脊椎动物的定性样品采集与鉴定应按照 HJ 710.8 的规定执行，加乙醇溶液固定（乙醇体积分数90%），常温保存。C.2.4鱼类样品采集与鉴定应按照 HJ 710.7 的规定执行，野外干冰或-20 保存，实验室-20 保存；或加乙醇溶液固定（乙醇体积分数90%），常温保存。C.2.5浮游动物、大型底栖无脊椎动物和鱼类的每个物种个体数不宜少于 5 个（株），浮游植物和着生藻类的纯培养藻种样品数不宜少于 5 个。C.2.6形态学鉴定应由三名具
40、有丰富鉴定经验的专业人员独立完成后汇总，结果不一致的重新鉴定，并保留凭证标本。C.3条形码扩增与测序C.3.1DNA 提取和浓度及纯度测定C.3.1.1常用 DNA 提取方法包括离心柱法和磁珠法。选取完整个体或合适部位的组织提取 DNA，避免外源污染。植物和动物组织 DNA 的提取分别参考 LY/T 3191 和 SN/T 4278。C.3.1.2按 GB/T 37874 的规定评价提取的 DNA 浓度和纯度，一般要求浓度不低于 1 ng/L，在 260 nm和 280 nm 波长处的吸光度值比值（OD260 nm/OD280 nm）应在 1.71.9 范围内，OD260 nm/OD230 n
41、m应2.0。有效的 DNA 样品分装为两份，一份在-80 长期保存，另一份保存在-20 用于后续试验，避免反复冻融。C.3.2条形码扩增与检测C.3.2.2针对不同生物类群选择引物扩增目标 DNA 条形码序列，常用 PCR 扩增引物和扩增反应条件参照表 B.1。C.3.2.2PCR 扩增产物通过 1%2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的有效性，应在目标长度位置出现一条单一的条带。若样品出现多个条带，需纯化 PCR 产物。具体过程参考 SN/T 4278。C.3.3测序使用 Sanger 法测序仪或第二代高通量测序仪对目标条带进行测序。为减少 Sanger 法测序出现双峰14DB32/T 4539202
42、3或者测序失败，可以先将 PCR 产物克隆到质粒中再进行测序。第二代高通量测序可为每个样本提供不少于 1 000 条高质量序列。Sanger 法测序要求参考 GB/T 34265，高通量测序要求参考 GB/T 30989 和GB/T 35537。C.4条形码评估C.4.1序列质量控制将一代测序双端测序文件进行拼接，按照 GB/T 34265 去除测序结果两端的低质量序列，序列方向应与 PCR 扩增正向引物方向一致。第二代高通量测序通常保留数量最多的序列，去除扩增引物，保证序列方向与 PCR 扩增正向引物方向一致。Sanger 测序和高通量测序分别达到 QV20 和 Q20。C.4.2遗传距离分
43、析C.4.2.1将有效的样本序列合并整理成 FASTA 格式的文件，采用 ClustalW、Muscle 等方法进行多序列核苷酸或氨基酸密码子比对，检查蛋白编码基因是否存在终止密码子，并修剪对齐双端序列。遗传距离计算基于有差异的核苷酸位点在序列中所占的比例，同时需要考虑 4 种核苷酸的发生频率和核苷酸替换类型。遗传距离计算模型包括 p 距离模型、JukesCantor 模型和 Kimura 两参数（K2P）模型，一般采用 K2P模型。C.4.2.2p 距离模型：利用两个同源基因 DNA 序列间的核苷酸差异数所占的比例来表示基因间的分歧度。C.4.2.3JukesCantor 模型：本模型假定
44、4 种核苷酸之间相互随机替代，即某一核苷酸替代变成其他 3 种核苷酸的概率是等同的。C.4.2.4Kimura 两参数模型：本模型将核苷酸替代分成转换替代和颠换替代，其中转换指 A、G 间替代或T、C 间替代。颠换指 A 和 T/C 间的替代或 G 和 T/C 间的替代。根据实际监测数据，核苷酸的转换替代率约为颠换替代率的 2 倍，该方法可以更加真实地反映核苷酸序列间的差异。C.4.3条形码有效性成功的物种条形码应同时满足以下条件：（1）阴性对照 PCR 无条带；（2）阳性对照的 PCR 产物在预期的 DNA 条形码序列长度位置出现目的条带；（3）同一个样本 Sanger 测序获得的序列相似性
45、99%；（4）同一个样本高通量测序获得的第一优势序列占比90%；（5）种内遗传距离明显小于种间距离（一般 510 倍）。C.5物种条形码入库成功的物种条形码相关信息导入 DNA 条形码数据库。DNA 条形码由样本信息、DNA 条形码信息、分类信息构成。样本信息库包括完整的样本采集和鉴定信息，即样本编号、凭证标本存放地、采样信息、分类信息、鉴定者、数张样本照片等。DNA 条形码信息包括每个样本扩增采用的引物，DNA 序列及基本信息统计。DNA 条形码信息表格可参考表 C.1。15DB32/T 45392023表 C.1 DNA 条形码信息表样本编号采样位点经纬度鉴定人/单位中文名DNA 条形码引
46、物信息GC 含量序列长度测序平台序列序列原始峰图采样人/单位海拔鉴定时间拉丁名16S 18S COI 线粒体 12S 其他：样本照片采样时间温度分类特征分类信息（门纲目科属种）C.6质量控制和安全管理C.6.1严格按标准要求进行信息采集，填写各项数据记录。记录表格编页装订成册，内容齐全，填写翔实，字迹工整、清晰。原始数据记录表、图片、样品和分类凭证标本应及时保存归档，并及时填写和归档电子数据（包括数据记录表和数码图片等）。C.6.2采样完成后，将所有样品运回实验室，与实验室人员交接，填写实验室样品记录表。将样品瓶上的所有信息抄写在实验室样品登记表上，按照采样区域或样点对样品登记表进行统一编号。
47、C.6.3试验场所应具备分子生物学实验室的基本条件。C.6.4为防止外源污染，试验前应将试验用具进行高压灭菌，并用 75%乙醇擦洗表面。C.6.5DNA 提取阴性对照（negative isolation control，NIC），用于监控 DNA 提取过程中的污染：在 DNA提取过程中设置一个空管，和样品同步操作。C.6.6PCR 扩增阴性对照（negative amplification control，NAC），用于排除 PCR 反应混合物制备过程中由于污染造成的假阳性：用无菌水替代 DNA 样品进行同步 PCR 扩增。C.6.7PCR 扩增效率的阳性对照（positive amplif
48、ication control，PAC）：添加等体积已知浓度的靶向生物的基因组 DNA，同步进行 PCR 扩增。16DB32/T 45392023附录D（资料性）生物统计表淡水生物环境 DNA 监测生物统计表见表 D.1。表 D.1 淡水生物环境 DNA 监测生物统计表检测单位样品采集日期测序日期分子分类单元编号序列门纲目点位名称样品处理日期测序引物科属种序列数相对丰度17DB32/T 45392023附录E（规范性）野外质量控制与保证E.1样品的采集E.1.1制定合理的采样操作程序，在确定的采样时间、采样点、采样层次，用符合质量要求的统一设备采样，采水量或采泥量尽量保持一致，以保证采集的样品
49、具有代表性和可比性。E.1.2保证所有野外设备处于良好的运行状态，应制定一项常规检查、维护及/或校准的计划，以确保野外数据的异质性和质量。E.1.3合理安排各类生物样品采集顺序，尽量避免生物类群在采集前受到较大扰动。E.1.4正确填写样品标签，包括样品编号、日期、水体名称、采样位置以及采集人姓名。E.1.5及时在现场处理样品。受生物活动影响，随时间变化明显的项目应在规定时间内测定。E.1.6水样采集后应选用冰袋或 4 短暂保存，并在 12 h 内完成过滤。E.1.7整个采样和前处理过程应保持无外源污染，并符合以下要求。a）应全程佩戴无菌实验手套，采集下一个样品应及时更换手套。建议佩戴口罩。b）
50、采样和前处理过程宜采用一次性无菌装置或耗材。对于重复使用装置和耗材，应选用 1.5%的次氯酸钠消毒不少于 1 min。c）重复使用的采样瓶，应浸泡在 1.5%的次氯酸钠中不少于 5 min，用蒸馏水重复冲洗 3 次，并晾干。在采样点，再次用水样冲洗三次，在采集样品前应除去任何残留的次氯酸钠。确保清洗后丢弃的水样未与待取的水样混合。d）应只从外部接触采样瓶，不应接触采样瓶及瓶盖内部。e）如果有必要进入水中采样，应使用胶靴，并在采样点之间进行消毒。清除鞋底和靴子两侧的所有污垢、鹅卵石和其他环境碎屑。f）水样过滤前，不应让手套接触被污染的表面，如任何未消毒的设备。若接触，应及时更换手套。g）过滤每个
