1、 ICS 65.020 CCS B 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 34552023 分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光PCR 法 Detection of onion yellow dwarf virus by real-time PCR on Shallot 2023-02-27 发布 2023-03-27 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 34552023 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则和GB/T 20001.42015标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法的规定起草。请注意本文件
2、中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林省农业科学院。本文件主要起草人：李小宇、张春雨、王海鹏、王永志、苏颖、李建平、张金花、杨阳、于红。DBXX/XXXXXXXXX 1 分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光 PCR 法 警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本文件描述了分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒实时荧光 PCR 检测方法。本文件适用于分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件
3、中的内容通过中文的规范性引用而构成本文件的必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 28067 甘蔗黄叶病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 3 术语和定义 GB/T 28067 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 比对洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因，设计一对仅在洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物。提取分蘖洋葱总 RNA，在反转录酶作用下反转录成 cDNA，并以其为模板，利用 Taq 酶进行实时荧光 PCR 扩增反应（采用 S
4、YBR Green 荧光染料方法）。SYBR Green 是一种具有绿色激发波长的染料，能够与双链 DNA 小沟区域结合。游离状态的 SYBR Green 只发出微弱的荧光，当与双链 DNA 结合后，荧光强度会显著增加，而且荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。5 试剂或材料 5.1 试剂 5.1.1 水：符合 GB/T 6682-2008 中一级水的要求。5.1.2 Trizol 核酸提取试剂盒。5.1.3 反转录试剂盒。5.1.4 实时荧光 PCR 试剂盒。5.1.5 DEPC（焦炭酸二乙酯 Diethy Pyrocarbonate）。5.1.6 三氯甲烷。DBXX/XXXXXXXXX 2
5、5.1.7 异丙醇。5.1.8 无水乙醇。5.1.9 DEPC 处理的水。5.1.10 DEPC 处理的 75%乙醇：无水乙醇（含量99.8%）与 DEPC 处理的水按 31 的体积比配置。5.2 引物 5.2.1 引物序列 上游引物：5-GCACGTTACGCATTCGACTT-3 下游引物：5-GCCTTCATCTGCATGTGTG-3 5.2.2 引物配制 引物用水稀释成 10 mol/L，-20 保存备用。6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3 电子天平：感量 0.01 g。6.4 高速冷冻离心机：离心力 12000 g 以上。6.5
6、 微量移液器：0.1 L2.5 L，2 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。6.6 恒温水浴锅。6.7 冰箱：4，-20，-80。6.8 离心管：DEPC 处理，1.5 mL。6.9 实时荧光 PCR 反应管：DEPC 处理，200 L。7 样品 7.1 对照样品 7.1.1 阳性样品 用已知含有洋葱黄矮病毒的新鲜管状叶作为阳性样品。7.1.2 阴性样品 用已知不含有洋葱黄矮病毒的新鲜管状叶作为阴性样品。7.2 试样 采集新鲜管状叶为宜，也可采集地下鳞茎。装入密封袋，置于冰盒中，4 保存不超过12 h，也可-80 长期保存。8 操作步骤 8.1 RNA 提取 DBXX/XX
7、XXXXXXX 3 8.1.1 离心管、药匙等经液氮预冷。8.1.2 称取 0.1 g 样品液氮充分研磨（检测鳞茎时，选择中部层取样。），转入 0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）处理的 1.5 mL 离心管中，立即加 1 mL Trizol 试剂，混匀，室温裂解 5 min。8.1.3 加 200 L 氯仿，充分摇晃混匀 15 s，室温静置 2 min3 min，4 12000 r/min 离心 15 min，取上层溶液转入新的 DEPC 处理的 1.5 mL 离心管中。8.1.4 加 0.5 mL 异丙醇，混匀，室温静置 10 min，4 12000 r/min 离心 10 min，弃上清。8
8、.1.5 加 1 mL DEPC 处理的 75%乙醇，涡旋震荡 1 min，4 12000 r/min 离心 5 min，弃上清。8.1.6 离心管开盖晾 5 min10 min 至管壁和管盖无液体，加入 40 L DEPC 水，混匀溶解，直接进行下步操作或-80 保存备用。8.1.7 用核酸蛋白分析仪测定 RNA 浓度。8.2 反转录 8.2.1 利用反转录试剂盒合成 cDNA 第一链，反应体系见表 1、表 2。表1 反应体系-1 试剂 体积 L 随机的 6 核苷酸引物 1 dNTP 混合溶液(10 mmol/L)1 模板 RNA 2.5 rnase free ddH2O 5.5 表2 反应
9、体系-2 试剂 体积 L 上述变性后反应液 10 5PrimeScript Buffer 4 rnase inhibitor(40 U/L)0.5 primeScript RTase(200 U/L)1 rnase free ddH2O 4.5 8.2.2 反应程序 8.2.2.1 反应体系-1，65 温浴 5 min，冰浴冷却备用。8.2.2.2 反应体系-2，30 10 min 后 42 1 h。8.3 实时荧光 PCR 反应 8.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 见表3。DBXX/XXXXXXXXX 4 表3 反应体系 试剂 剂量 L 终浓度 2Magic SYBR Mixtrue 1
10、0 1 上游引物（10 M）0.6 0.3 M 下游引物（10 M）0.6 0.3 M cDNA 2 10 ng200 ng ddH2O 补齐至 20 8.3.2 反应程序 预变性95 5 min，变性95 30 s，退火延伸60 15 s，40 个循环。9 试数据处理 9.1 结果分析条件设定 读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果呈阴性为准。9.2 检测结果的判定 根据 Ct 值判定检测结果，在阳性对照、阴性对照和空白对照检测结果与预期一致的前提下：a)检测样品的 Ct 值小于 35，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性。b)检测样品的 Ct 值介于 3540，且出现特定的扩增曲线，需重新进行实时荧光 PCR 检测。若重新检测的 Ct 值仍介于 3540，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性；否则判为阴性。c)检测样品的 Ct 值大于 40，或未出现特定的扩增曲线，判定结果为阴性。10 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a)试验对象；b)所使用的标准；c)所使用的方法；d)结果；e)观察到的异常现象；f)试验日期。_
