1、ICS11.220CCS B 4121辽宁省地方标准DB21/T 37872023非洲猪瘟病毒 LAMP 目视检测方法Loop-mediated Isothermal Amplification（LAMP）Visual DetectionMethod for African Swine Fever(ASFV)2023-07-30 发布2023-08-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 37872023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15生物安全基本要求.16方法原理.17设备、试剂和材料.28检测步骤.2附录 A（规范性）溶液制备.4DB2
2、1/T 37872023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中联瑞（北京）生物科技有限责任公司。本文件主要起草人：兰德松、于本良、顾贵波、曹际娟、周维、赵培、葛忠源、张雅为、孙世宇、杨作丰、刘贺、杨国丽、张春姝。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽
3、宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话：024-88420057。DB21/T 378720231非洲猪瘟病毒 LAMP 目视检测方法1范围本文件规定了非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus）LAMP目视检测方法的生物安全基本要求，方法原理，设备、试剂和材料，检测步骤等技术内容。本文件适用于非洲猪瘟的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪全血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓、拭子等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过
4、文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ASFV：非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus）Bst：嗜热硬脂芽孢杆菌（Bacillus Stearothermophilus)DEPC：焦炭酸二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate）EDTA-2Na：乙二胺四乙
5、酸二钠（Ethylene Diaminetetraacetic Acid Disodium）LAMP：环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification）RM：反应液（Reaction Material）5生物安全基本要求进行ASFV检测活动时，应按照GB 19489规定执行。6方法原理针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，并引入环引物加快反应，在链置换DNA聚合酶的作用下，基因模板、引物、链置换型DNA合成酶等在60 65 进行恒温扩增，15 min60 min左右即可实现109倍1010倍的核酸扩增。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(d
6、NTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，经钙黄绿素染色，呈现绿色肉眼可见的沉淀物。DB21/T 3787202327设备、试剂和材料设备二级生物安全柜、高速台式冷冻离心机、组织研磨仪、冰箱（2 8 和-20 以下）、金属浴或恒温水浴锅（25 100）、微量移液器（量程：0.5 L10 L、2 L20 L、20 L200 L和200 L1000 L）。试剂ASFV LAMP扩增用引物、2反应液（RM）、Bst 2.0 DNA聚合酶、荧光染料、阳性对照、阴性对照、DEPC处理水。试剂的溶液制备见附录A。材料核酸提取试剂盒、离心管（15 mL、1.5 mL）、0.
7、2 mL PCR反应管、移液器吸头（10 L、200 L、1000 L）。8检测步骤样品采集准备8.1.1采样人员符合NY/T 541-2016中的规定。8.1.2采样工具和器材符合NY/T 541-2016中的规定。样品采集8.2.1血液样品：按照 NY/T 541-2016 中第 6.1 条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注入含 1/10 体积 4%EDTA-2Na 溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备检。8.2.2脏器、组织样品：按照 NY/T 541-2016 中第 6.2 条和 6.3 条中的要求进行，将采集的病死猪或剖杀猪主要脏器（脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏等）、骨髓等样品使
8、用组织研磨仪或研钵在二级生物安全柜内进行研磨处理后用于核酸提取。8.2.3拭子样品：按照 NY/T 541-2016 中相关要求进行。样品保存、包装和废弃物处理按照NY/T 541-2016执行。样品运输按照NY/T 541-2016执行。DNA 提取DNA提取应在样本制备区内进行，采用商品化核酸提取试剂盒按说明书提取样本核酸，样本核酸在-20 以下冷冻保存备用。DB21/T 378720233LAMP 扩增反应8.6.1体系的配制和分装在试剂配制区进行。设所需PCR管数为n（n=待测样品数+1管阴性对照+1管阳性对照）。按n+1计算好各试剂的使用量，按表1配制，加入1.5 mL离心管中，充分
9、混匀后，按23 L/管分装至PCR管并编号。表 1每个反应体系配制表组分用量2反应液（RM）12.5 LFIP溶液（100 mol/L）0.4 LBIP溶液（100 mol/L）0.4 LF3溶液（100 mol/L）0.05 LB3溶液（100 mol/L）0.05 LLB溶液（100 mol/L）0.2 LBst 2.0 DNA聚合酶1 L荧光染料1 LDEPC处理水7.4 L总体积23 L8.6.2加样向上述编号的PCR管中分别加入制备的阴性对照核酸、阳性对照核酸和样本核酸各2 L，扣紧混匀后，采用1 s3次的方式瞬时离心，之后转移至扩增区。8.6.3PCR 扩增检测在PCR扩增区进行。
10、将PCR反应管放入金属浴或恒温水浴锅等设备中，设置温度63，时间55 min。结果判定8.7.1质量控制自然光下，阳性对照为绿色荧光，阴性对照为橘黄色无荧光，则试验成立。8.7.2结果判定自然光下，看到绿色荧光、淡绿色荧光、浅绿色荧光，判为阳性；看到橘黄色无荧光，判为阴性。DB21/T 378720234AA附 录A（规范性）溶液制备A.1引物的名称和序列引物的名称和序列见表A.1。表 A.1 引物名称和序列引物名称序列（5-3）内引物FIPAGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGGGAGTCATTAATGAAATCTCGC内引物BIPTACACAACCTTTTTGTAAAACGCG
11、TATTGTTGGTGTGGGTCAC外引物F3CGCAATATACGCTTTAAACCA外引物B3ACATTAGTTTTTCATCGTGGTG环引物LBTCGCTTTTCGCTGATACGTGA.2引物混合物的制备取引物对（内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、环引物LB）干粉，按引物说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混匀，得到各引物溶液，置-20 保存。A.32反应液（RM）的制备本方法采用的2反应液（RM）为商品化的2反应液（RM）。A.4Bst 2.0 DNA 聚合酶的制备本方法采用的Bst 2.0 DNA聚合酶为商品化的Bst 2.0 DNA聚合酶。A.5荧光染料的制备本方法采用的荧光染料为商品化的荧光目视检测试剂。A.6阳性对照采用核酸蛋白质分析仪测定阳性质控品浓度，计算质粒拷贝数，用无菌纯化水将其稀释为103copies/L，100 L/管分装，-20 保存。A.7阴性对照取健康猪血清，100 L/管分装，-20 保存。A.8DEPC 处理水DEPC 1 mL，加入灭菌双蒸水1000 mL中充分混匀后，121 高压灭菌后分装，4 保存。
