1、ICS11.220CCS B 4121辽宁省地方标准DB21/T 37852023牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术规程Detection of brucellosis in cattle and sheep by Fluorescence PolarizationAssay(FPA)2023-07-30 发布2023-08-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 37852023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15生物安全要求.16技术原理.17设备试剂与材料.28样品采集和处理.29操作前准备工作.210试验操作.2附录 A（规范性）
2、试剂配制.5DB21/T 37852023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、锦州市疾病预防控制中心、哈尔滨平河生物技术有限公司、辽宁中科基因技术有限公司。本文件主要起草人：张雅为、于本良、顾贵波、兰德松、朱江巍、王克才、陈瑶、段亚良、李井春、孙世宇、魏澍、张辉、刘坤洋、刘佳、白梅、张旭、李泽钦、张祎。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式
3、进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址:辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话：024-88420057。DB21/T 378520231牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术规程1范围本文件规定了牛、羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测的生物安全要求、技术原理、设备试剂与材料、样品采集和处理、操作前准备、试验操作等技术内容。本文件适用于牛、羊布鲁氏菌抗体水平的初筛检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性
4、引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室 生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FPA:荧光偏振检测（Fluorescence Polarization Assay）mP:荧光偏振值（Millipolarisation Units）OPS:O-多糖（O-Polysaccharide）DEAE:二乙氨基乙基葡聚糖FI
5、TC:荧光素异硫氰酸酯5生物安全要求为了保护实验室检测人员的安全，实验操作应在相应级别的生物安全实验室内进行，严格按照 GB19489 和 NY/T 1948 要求执行。6技术原理溶液中的分子作随机转动，分子的大小是影响转动速率的主要因素，与其成反比关系，因而小分子较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5角度的转动时间，可以通过测量水平和垂直的偏振光强度来确定。DB21/T 378520232诊断布鲁氏菌病时，采用牛种布鲁氏菌LPS的小分子量片段(平均22KD)，标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)作为抗原，被检血清中若有抗体存在，与标记抗原结合后就会降低其转动速度，使用荧光偏振分
6、析仪测定出偏振值，通过偏振值判断样品的阴、阳性。7设备试剂与材料设备荧光偏振检测仪（试管型便携式FPA仪、台式FPA分析仪）、微量移液器（1 L10 L、20 L200L、100 L1000 L）、多道移液器（10 L200 L）、旋涡振荡器。试剂标准阳性血清（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂）、标准阴性血清（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂）、FPA标记抗原（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂，配置方法见附录A.1）、FPA样品稀释液（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂，配置方法见附录A.2）、氯化钠、Tris、Tween-20、EDTA。材料10 mm75 mm硼硅玻璃试管（试管应
7、清洁无指纹等，且无刮痕）、96孔黑色平底微量板、吸头（10L、200 L、1000 L）。8样品采集和处理按照NY/T 541中的方法采集和分离受检牛、羊的血清，分离后的血清应清亮透明没有溶血现象和腐败现象，血清量通常为 1 mL备用。9操作前准备工作将试剂和样品恢复至室温（18 26），检测操作应在室温（18 26）下进行。10试验操作试管法检测10.1.1仪器校准10.1.1.1每天第 1 次试验前或 FPA 检测仪被移动后，都要检测对照血清。10.1.1.2在两个 10 mm75 mm 硼硅玻璃试管中分别加入 1 mL 的 FPA 样品稀释液。10.1.1.3在两个试管中分别加入 10
8、L 的阳性和阴性对照血清，充分混合均匀（旋涡混合器振动 5s）。10.1.1.4使用试管型便携式 FPA 仪分别读取两管的空白密度值。10.1.1.5每管加入 10 L 的 FPA 标记抗原，充分混合均匀（旋涡混合器振动 5s）。10.1.1.6孵育至少 2min，最长不超过 5min。10.1.1.7使用便携式 FPA 仪读取两管的 mP 值。试管的检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。DB21/T 37852023310.1.1.8对照结果：阴性对照牛血清的 mP 值低于 90 mP（通常在 75 mP 左右）；阳性对照血清的 mP值在 200 mP 左右，则对照成立，可以进行样品检测。否
9、则，按照 FPA 仪器的操作软件和操作程序，调试 FPA 检测仪的参考因子值，使对照成立，才可进行样品的检测。10.1.2样品检测10.1.2.1向每个 10 mm75 mm 硼硅玻璃试管加入 1 mL 的 FPA 样品稀释液，试管数量等于样品数量。10.1.2.2在上述试管中加入待检血清，用旋涡混合器振动 5 s 充分混合均匀。各畜种血清稀释度具体如下：a)牛血清按10 L血清加到1.0 mL 样品稀释液中稀释；b)绵羊血清按25 L血清加到1.0 mL 样品稀释液中稀释；c)山羊血清按40 L血清加到1.0 mL样品稀释液中稀释。10.1.2.3使用试管型便携式 FPA 仪读取被检样品试管
10、的空白密度值。10.1.2.4在上述试管中加入 10 L 的 FPA 标记抗原，旋涡混合器振动 5 s 充分混合均匀。10.1.2.5孵育 2 min5 min。10.1.2.6使用试管型便携式 FPA 仪读取被检样品的 mP 值。试管的测量顺序与读取空白密度值时的顺序一致。10.1.3结果判定10.1.3.1没有接种布鲁氏菌病疫苗的动物：样品 mP 值大于其阈值时，判为阳性；mP 值小于阈值时，判为阴性；mP 值等于阈值时，需重新检测。牛、羊血清阈值如下：a)牛血清阈值为95 mP；b)绵羊血清阈值为78 mP；c)山羊血清阈值为88 mP。10.1.3.2已经接种 A19 疫苗 12 个月
11、以后或接种 S2 疫苗 6 个月以后的动物：a)牛血清95 mP为阴性；95 mP检测值115 mP为可疑；116 mP为阳性；b)绵羊78 mP 为阴性；78 mP检测值88 mP为可疑；88 mP为阳性；c)山羊88 mP为阴性；88 mP为阳性。d)试验结果可疑牛、羊经60 d90 d后采血重检，如果结果仍为可疑，判为阳性。微量法检测10.2.1仪器校准10.2.1.1每天第 1 次试验前或 FPA 检测仪被移动后，都要检测对照血清。10.2.1.2在干净的 96 孔黑色平底微量板的第 1 列中的 6 个孔中分别加入 190 L FPA 样品稀释液。复孔分别加入 10 L 的阳性（C+）
12、、阴性（C-）的对照牛血清和样品稀释液（Cc）10.2.1.3振动 2 min，充分混合均匀。使用台式 FPA 仪读取平板的空白密度值。10.2.1.4每孔加入 10 L FPA 标记抗原，振动 2 min，充分混合均匀。10.2.1.5孵育 2 min5 min。10.2.1.6使用台式 FPA 分析仪读取平板的检测密度值 mP 值。检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。10.2.1.7对照结果：阴性对照血清的 mP 值低于 90 mP（通常在 75 mP 左右）；阳性对照血清的 mP 值在 200 mP 左右，则对照成立，可以进行样品检测。否则，按照 FPA 仪器的操作软件和操作程序，调试
13、FPA 检测仪的参考因子值，使对照成立，才可进行样品的检测。DB21/T 37852023410.2.2样品检测10.2.2.1在干净的 96 孔黑色平底微量板中每个孔加入 190 L FPA 样品稀释液。其中设置阳性对照和阴性对照孔各两个。10.2.2.2向每个对照孔和样品孔中分别加入 10 L 的阳性、阴性对照血清和被检牛血清（1 个孔检测1 个样品），室温下振动 2 min，充分混合均匀。96 孔黑色平底微量板置入荧光偏振检测仪中进行第一次读数，得到对照血清和样品的空白值。10.2.2.3从 FPA 检测仪上取出 96 孔板向每个孔中分别加入 10 L 的 FPA 标记抗原，室温下振动
14、2 min，充分混合均匀。10.2.2.4非自动加样的台式 FPA 检测仪，需要将 96 孔黑色平底微量板置入荧光偏振检测仪中进行第2 次读数，得到对照血清和样品的 mP 值。平板的测量顺序与读取空白板时的顺序一致。10.2.2.5自动加样的台式 FPA 检测仪，后续程序设置好后，仪器自动加入 10 L 的 FPA 标记抗原、然后振动 2 min，充分混合均匀；再孵育至少 2 min；FPA 检测仪进行第 2 次读数，得到对照血清和样品的 mP 值。10.2.3结果判定10.2.3.1阴性对照血清的读值介于 60 mP90 mP 之间，阳性对照血清的读值介于 140 mP300 mP之间，试验
15、成立。10.2.3.2没有接种布鲁氏菌病疫苗的牛、已经接种 A19 疫苗 12 个月或接种 S2 疫苗 6 个月后的牛检测，结果判定如下:a)牛血清95 mP为阴性；95 mP检测值115 mP为可疑；116 mP为阳性；b)试验结果可疑牛经60 d90 d后采血重检，如果结果仍为可疑，判为阳性。DB21/T 378520235AA附录A（规范性）试剂配制A.1FPA 标记抗原制备制备OPS时，5 g干重(或50g湿重)牛种产布鲁氏菌S119-3株菌体悬液中加入400 mL2%(V/V)醋酸，121 高压灭菌15 min，于5 3 10000 g离心10 min，去除菌体碎体。然后，上清液用2
16、0 g 的三氯醋酸沉淀任何蛋白质和核酸,4 1000 g再离心10 min去除沉淀。取上清液置100倍体积的蒸馏水透析，浓缩后冻干备用。将3 mg OPS溶于0.6 mL0.1 M的氢氧化钠(4克NaOH/升)中，37 2 孵育1 h，加入二甲亚砜配制的异硫氰酸荧光素异构体-I(浓度为100 mg/mL)0.3 mL 再于37 2 温育1 h。结合的OPS加到110 cm的用0.01 M pH（7.40.2）磷酸缓冲液平衡的DEAE层析柱上。加10 mL15 mL缓冲液后为亮绿色，然后换为pH（7.40.2）的0.1 M的磷酸缓冲液，这将导致10 mL15 mL的缓冲液洗脱后有25 mL40 mL的绿色荧光物质洗脱下来。将此物质用作FPA 中的抗原。抗原可按比例增加。试验所用抗原的量可通过洗脱上述物质直至FPM的荧光强度达到250000至300000 而确定。抗原于5 3 以液体状态可贮存于深色瓶中数年，或冻干保存于深色瓶中。标记抗原可以从少量商业来源处获得。A.2FPA 样品稀释液称取8.5 g氯化钠，12.1 g Tris，0.5 mL Tween-20，5.7 g EDTA，加蒸馏水至1000 mL，混匀。调节pH值至7.2，121 高压灭菌30 min。室温保存。直接使用。
