1、ICS 13.060.99CCS Z 10DB21辽宁省地方标准DB21/T 37942023水质 底栖动物鉴定 DNA 条形码法Water QualityIdentification of MacrobenthosDNA Barcoding2023-08-30 发布2023-09-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 37942023I目次前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 缩略语.25 方法原理.36 试剂和材料.37 仪器和设备.48 样品.49 分析步骤.410 结果计算.711 质量保证与质量控制.712 废物处理.813 注意事项.8附录
2、A（资料性）序列搜索与比对.9附录 B（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算.11参 考 文 献.13DB21/T 37942023II前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省生态环境厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省生态环境监测中心。本文件主要起草人：丁振军、李杨、姜永伟、王星蒙、问青春、王秋丽、张爽、胥学鹏、张峥、卢雁。本文件为首次发布。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及
3、时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省生态环境厅（辽宁省沈阳市浑南区双园路 30 甲），联系电话：024-62788591。文件起草单位通讯地址：辽宁省生态环境监测中心（辽宁省沈阳市浑南区双园路 30 甲-3），联系电话：024-62780471。DB21/T 379420231水质 底栖动物鉴定 DNA 条形码法警告：EB 溶液具有遗传毒性，操作时应按规定要求佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。1 范围本文件规定了利用 DNA 条形码技术鉴定底栖动物的方法。本文件适用于河流、湖泊和水库中底栖动物的鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引
4、用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 30989高通量基因测序技术规程HJ 710.8生物多样性观测技术导则 淡水底栖大型无脊椎动物T/CSES 81淡水生物监测 环境 DNA 宏条形码法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1底栖动物 macrobenthos指生活史的全部或至少一个时期栖息于水体底部或底部基质中的不能通过 0.5 mm（40 目）孔径网筛的无脊椎动物。来源：HJ 710.8-2014，3.2，有修改3.2细胞色素 c 氧化酶亚基 Icytochr
5、ome coxidase subunit I，COI后生动物线粒体基因组上的线粒体细胞色素 c 氧化酶亚基 I 对应的 DNA 序列。来源：T/CSES 81-2023，3.7，有修改3.3引物 primer在 DNA 复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。来源：GB/T 30989-2014，3.113.4退火 annealing模板双链 DNA 经热变性、双螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到特定温度，使引物与该模板 DNADB21/T 379420232单链重新配对，形成新的双链分子的过程称为退火。3.5聚合酶链式反应 polym
6、erase chain reaction，PCR模板 DNA 先经高温变性为单链，在 DNA 聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与模板 DNA 两条链上的一段互补序列发生退火，接着在 DNA 聚合酶的催化下以四种 dNTP 为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和 DNA 合成这一循环，使位于两段已知序列之间的 DNA 片段呈几何倍数扩增。来源：GB/T 30989-2014，3.143.6降落 PCRtouchdown PCR，TD PCR一种退火温度逐渐降低的多循环 PCR 反应程序。由于前期退火温度高，引物结合难度增大，错配几率降低，目的片段的产率较低但准确率较高。后期随着退火温
7、度的降低，前期积累的正确目的片段会被大幅扩增，使最终产物中目的片段的特异性大幅提高。3.7序列比对 sequence alignment指运用特定的算法检测两个或多个序列之间的相似性，用于发现生物序列中的功能、结构和进化的信息。3.8遗传距离 genetic distance遗传距离指不同的种群或种之间的基因差异的程度，并以数值进行度量。3.9生物大分子序列比对搜索工具 Basic Local Alignment Search Tool，BLAST一种基于局部比对算法的搜索工具，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。3.10
8、分子进化遗传分析工具 Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA一种用于分析物种亲缘关系、分子功能、遗传进化等的工具。可以实现序列比对和调参建树等功能。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。EB溴化乙锭（Ethidium bromide）DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）COI细胞色素氧化酶亚基 I（cytochrome coxidase subunit I）PCR聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）BLAST生物大分子序列比对搜索工具（Basic Local Alignment Sear
9、ch Tool）MEGA分子进化遗传分析工具（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）DB21/T 3794202335 方法原理酚作为蛋白质变性剂使蛋白质变性，SDS 将细胞裂解，蛋白酶 K 消化蛋白质成多肽，使 DNA 从蛋白质中游离出来。DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂，离心后有机相在下层，DNA 存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间，从而分离得到总 DNA。PCR 反应可特异性的扩增正向引物和反向引物间的序列，经 35 次循环，目标 COI 序列可被扩增约 235倍。与 DNA 结合的 EB 会被紫外光激发发出强烈的橙红色荧光，比未结合的
10、EB 荧光强度高几十倍，从而扩增的 COI 序列可被检测到。获得的 COI 序列经测序在 NCBI或 BOLD 等公共数据库中搜索相似序列。将测序结果与搜索得到的序列一起绘制 NJ 进化树并计算遗传距离，一般遗传距离小于 0.02 cM 的认为是同一种。DNA 条形码法鉴定底栖动物流程图见图 1。图 1 DNA 条形码鉴定底栖动物流程图6 试剂和材料6.1 无菌水：去离子水 121 灭菌。6.2 无水乙醇（C2H6O）。6.3 70%乙醇。6.4 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA，C10H14N2O8Na22H2O）。6.5 三羟甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3）。6.6 十二烷基硫酸
11、钠（SDS，C12H25SO4Na）。6.7 10%SDS 溶液：称取 SDS 10 g，加入约 60 mL 去离子水，加热溶解，用浓盐酸调节 pH 至 7.2，去离子水定容至 100mL，常温备用。6.8 三氯甲烷（CHCl3）。6.9 Tris 饱和酚溶液（pH 7.78.1，市售）。6.10 蛋白酶 K 溶液：400 U/mL（市售）。6.11 EB 储存液：10 mg/mL（市售）。6.12 EB 工作液：吸取 10 L EB 储存液加入 200 mL 去离子水中，混匀，终浓度为 0.5 g/mL。6.13 琼脂糖（标准熔点）。提取总DNA电泳、凝胶成像检查总 DNA 提取情况PCR
12、扩增COI 片段电泳、凝胶成像检查PCR 扩增结果委托测序序列搜索与比对绘制进化树并计算遗传距离结果判读DB21/T 3794202346.14 1%琼脂糖凝胶：称取 0.3 g 琼脂糖，加入 30 mL 去离子水，微波炉加热至恰好全部熔化，立即倒入制胶槽中，插入制胶梳，临用现制。可根据制胶槽大小适当调整琼脂糖凝胶的制备量。6.15 1TE 缓冲液：pH 缓冲范围 7.58.5（市售）。6.16 50TAE 缓冲液（市售）。6.17 1TAE 缓冲液：取 20 mL 50TAE 缓冲液，去离子水定容至 1 L，常温备用。pH 缓冲范围 7.88.8。6.18 6蔗糖凝胶上样缓冲液：含溴酚蓝、E
13、DTA（市售）。6.19 2Taq PCR Mix 预混液：含 Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR 缓冲液和溴酚蓝（市售）。6.20 DNA 分子量标准（含上样缓冲液，市售）：100 bp2000 bp，包含 6 条单一 DNA 条带，分别为：100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp。6.21 PCR 引物：LCO1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG），HCO2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA）。7 仪器和设备7.1 天平：准确到 0.001 g。7.2 干式恒温器：56 可调。
14、7.3 PCR 仪：PCR 反应程序可编辑。7.4 水平电泳仪：电压 100 V 可调。7.5 离心机：12000 r/min 可调。7.6 凝胶成像仪：具有紫外成像功能。7.7 移液器：2.5 L、10 L、100 L、200 L、1 mL。8 样品8.1 样品采集底栖动物的采集按照 HJ 710.8 相关规定执行。8.2 样品保存底栖动物样品采集后，用无水乙醇冲洗干净，保存于无水乙醇中，冷冻条件下可长期保存。现场无冷冻条件的，应 4 冷藏保存并尽快送到实验室转为冷冻保存，冷藏条件保存不应超过 3 天，以防 DNA发生分解。9 分析步骤9.1 总 DNA 的提取组织样本宜取自底栖动物肌肉部位
15、，该部位线粒体丰富，易于获得较好的扩增效果。可选取底栖动DB21/T 379420235物个体腿部或胸部组织，如底栖动物个体较小（如摇蚊幼虫），可将整个个体放入 EP 管中进行总 DNA提取。取约 25 mg 组织样本，用无水乙醇反复清洗数次，滤纸吸干，放入 1.5 mL EP 管中，加入 500 LTE 缓冲液（6.15），100 L 10%SDS 溶液（6.7），20 L 蛋白酶 K（6.10），56 恒温 2 h4 h 至完全消化，消化前期应不时摇晃 EP 管，使管内溶液混匀。消化完成后，加入 Tris 饱和酚（6.9）600 L，混匀 10 min，12000 r/min 离心 10
16、min。取上清液加入 1/2 体积的三氯甲烷（6.8）、1/2 体积的 Tris 饱和酚，混匀 10 min，12000 r/min 离心 10 min。取上清液加入相同体积的三氯甲烷，混匀 10 min，12000 r/min 离心 10 min。取上清液加入 2 倍体积的预冷至 4 的无水乙醇，-20 沉淀 1 h2 h，12000 r/min 离心 10 min，小心倒掉上清液。使用预冷至 4 的 70%乙醇 400 L 清洗杂质，轻微摇晃 1 min，12000 r/min 离心 2 min，弃去上清液。再次使用预冷的 70%乙醇 400 L 清洗杂质，12000 r/min 离心 2
17、 min，弃去上清液。EP 管开盖置于通风处使残留的乙醇挥发，加入 100 L 去离子水溶解 DNA 沉淀，-20 保存。总 DNA 提取流程见图 2。图 2 总 DNA 提取流程图也可使用市售试剂盒提取总 DNA，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书。建议优先选用市售试剂盒提取。9.2 总 DNA 的电泳检测提取的总 DNA 应进行琼脂糖凝胶电泳检测，以判断总 DNA 提取情况。1%琼脂糖凝胶（6.14）制备完成后连同制胶槽一同放入电泳槽 TAE 缓冲液中，上样孔放置于电泳仪12000r/min 离心10 min取 25 mg 组织，无水乙醇清洗数次加入 500 L TE缓冲液，100 L10%
18、SDS 溶液，20L 蛋白酶 K56 恒温至完全消化加入 Tris 饱和酚 600 L混匀12000r/min 离心 10 min弃上清，用4 的 70%乙醇 400 L 清洗杂质12000r/min 离心2min重复一次弃上清，打开 EP 管盖挥发残留乙醇加入 100 L 去离子水溶解 DNA沉淀，-20 保存取上清液加入 1/2体积的三氯甲烷、1/2 体积的 Tris 饱和酚，混匀12000r/min 离心10 min取上清液加入相同体积的三氯甲烷，混匀12000r/min 离心10 min取上清液加入2 倍体积 4 的无水乙醇，-20 沉淀1 2 hDB21/T 379420236负极方
19、向，并使缓冲液液面略微超过凝胶上表面。吸取 2.5 L DNA 分子量标准（6.20）小心加入到第一个上样孔中；总 DNA 样品和 6蔗糖凝胶上样缓冲液（6.18）按 5:1 混合均匀，吸取 2.5 L 混合后的样品加入空上样孔中。计算电泳槽正负极间的距离，调节电泳仪，使电压不超过 5 V/cm8 V/cm。开始电泳，当溴酚蓝染料条带移动至凝胶约 2/3 位置时，电泳结束。9.3 EB 染色将结束电泳的琼脂糖凝胶从制胶槽中取出，放入 EB 染色液（6.12）中，使 EB 染色液没过凝胶，染色 30 min。取出后清水漂洗两次。注：也可使用其他染料替代 EB，具体使用方法参见相关试剂说明书。9.
20、4 总 DNA 的凝胶成像将染色并漂洗后的凝胶放入凝胶成像仪中，紫外成像拍照，与 DNA 分子量标准对比，提取的总 DNA大小一般大于 2000 bp。9.5 PCR 扩增PCR 反应体系为 50 L，应用降落 PCR，退火温度从 60 开始下降到 45，每 2 次循环下降 1，此阶段共 30 次循环；再以 45 为退火温度循环 5 次。整个 PCR 过程共计 35 次循环。PCR 反应体系和 PCR 反应程序见表 1 和表 2。表 1PCR 反应体系序号试剂加入量（L）12Taq PCR Mix 预混液252模板 DNA2.53正向引物24反向引物25无菌水18.5DB21/T 379420
21、237表 2PCR 反应程序步骤温度（）时间（min）循环次数预变性945变性940.5退火温度每两次循环降低1，30 次循环退火60450.5延伸721.5变性940.55 次循环退火450.5延伸721.5延伸7210保存49.6 扩增产物的电泳检测扩增产物按步骤 9.2 进行电泳检测。9.7 EB 染色扩增产物电泳结束后按步骤 9.3 进行 EB 染色。9.8 PCR 扩增产物的凝胶成像染色并漂洗后的凝胶按步骤 9.4 进行 PCR 扩增产物的凝胶成像分析。9.9 测序扩增的 COI 序列可委托专业测序公司进行基因测序，测序结果文件为 fasta 格式。10 结果计算10.1 序列搜索与
22、比对测试样品的测序结果在 NCBI 等国际公共数据库中 BLAST 搜索相似序列，一般要求相似性大于 95%，将搜索得到的一条或多条相似序列与测序结果一起在 MEGA 等软件中进行序列比对（附录 A）。10.2 绘制 NJ 进化树并计算遗传距离比对完成后的结果使用 Kimura 2-parameter（K2P）模型，自展值（Bootstrap）不低于 1000，绘制 NJ 进化树，计算遗传距离（附录 B）。10.3 结果判读若进化树上测试样品与搜索得到的序列聚为一支，且遗传距离小于 0.02 cM，即可判定测试样品与该序列为同一物种。11 质量保证与质量控制11.1 实验前的分类鉴定每次实验前
23、应先对物种进行目或科的简单分类鉴定。11.2 平行样的测定每次实验需开展平行双样测试，两次鉴定结果需完全相同，否则应查找原因并重新测试。DB21/T 37942023812 废物处理对于废弃的 EB 溶液可做如下处理：对于 EB 含量大于 0.5 mg/mL 的溶液，将 EB 溶液用水稀释至浓度低于 0.5 mg/mL。加入一倍体积的0.5 mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的 2.5 mol/L 盐酸，混匀，置室温数小时。加入一倍体积的 2.5 mol/LNaOH，混匀后按有毒有害废物处理。对于 EB 含量小于 0.5 mg/mL 的溶液，按 1 mg/mL 的量加入活性炭，不时轻摇混
24、匀，室温放置 1 小时。用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后按有毒有害废物处理。13 注意事项EB 具有毒性，实验室内应划分清洁区与 EB 污染区。实验时应带好手套等防护措施，若沾染 EB 后应使用大量清水清洗。DB21/T 379420239附 录 A（资料性）序列搜索与比对A.1 序列搜索序列搜索在 NCBI 网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行，选择“ResourcesDNA&RNABLAST（BasicLocal Alignment Search Tool）”，然后点击“Nucleotide BLAST”按钮（图 A.1），进入到序列搜索界面。在搜索框中输
25、入需要搜索的测序结果序列，点击“BLAST”搜索相似序列（图 A.2），以“.fasta”格式下载搜索结果列表（图 A.3）中相似度最高的序列进行比对。图 A.1Nucleotide BLAST 界面图 A.2BLAST 搜索序列界面输入需要搜索的序列DB21/T 3794202310图 A.3BLAST 搜索结果界面A.2 序列比对将测序结果序列与搜索得到的序列放在同一个 fasta 文件中，在 MEGA 软件中打开该 fasta 文件，选择“Align by ClustalW”进行序列比对，比对结果（图 A.4）另存为“.meg”格式进行进化树的构建和遗传距离的计算。图 A.4序列比对结果
26、界面DB21/T 3794202311附 录 B（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算B.1 进化树的构建将比对完成并保存的 meg 文件加载进 MEGA 软件，点击“Construct/Test Neighbor-Joining Tree”，选用“Bootstrap method”，自展值至少为 1000 次，模型选择“Kimura 2-parameter model”（图 B.1），点击“OK”开始构建进化树。构建的进化树如种类过多矩形树无法全部显示，可选用圆形树展示（图B.2），观察测试样本与搜索到的样本的聚类情况。图 B.1使用 K2P 模型构建 NJ 进化树的设置界面DB21/T 3
27、794202312图 B.2使用 K2P 模型构建的 NJ 进化树B.2 遗传距离的计算点击“Compute Pairwise Distances”，同样选用“Bootstrap method”，自展值至少为 1000 次，模型选择“Kimura 2-parameter model”（图 B.3），点击“OK”开始计算遗传距离。图 B.3基于 K2P 模型计算的遗传距离DB21/T 3794202313参 考 文 献1 HJ 710.8-2014,生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物S.2 Arnot D E,Roper C,Bayoumi R A L.Digital codes fr
28、om hypervariable tandemLy repeatedDNA sequences in the Plasmodium falciparum circumsporozoite gene can genetically barcodesisolatesJ.Molecular and biochemical parasitology,1993,61(1):15-24.3 Tautz D,Arctander P,Minelli A,et al.DNA points the way ahead in taxonomyJ.Nature,2002,418(6897):479-479.4 Heb
29、ert P D N,Cywinska A,Ball S L.Biological identifications through DNA barcodesJ.Proceedings of the Royal Society of London B:Biological Sciences,2003,270(1512):313-321.5 Hebert P D N,Ratnasingham S,de Waard J R.Barcoding animal life:cytochrome c oxidasesubunit I divergences among closely related speciesJ.Proceedings of the Royal Society ofLondon B:Biological Sciences,2003,270(1):S96-S99.6 M R 格林,J 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南（第四版）M.贺福初,译.北京:科学出版社,2017:383-385.7 孙家梅.白蛉的数值分类和基于 DNA 条形码的分子系统学研究D.暨南大学,2010.8 杨瑞生,钟亮,姜义仁,等.橡实象虫等 25 种昆虫线粒体 COI 基因的遗传多样性及系统进化分析J.蚕业科学,2011,37(06):985-992.
