1、ICS65.120CCS B 4621辽宁省地方标准DB21/T 36982023饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测Method for determination of Clostridium butyricum in feeds2023-02-28 发布2023-03-28 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 36982023I目次1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15稀释液、培养基及试剂.16设备和实验器材.17检验程序.28采样.39试样的制备.310操作步骤.311确证试验.412结果计算与报告.5附录 A（规范性）培养基和试剂.7附录 B（资料性）细菌 D
2、NA 提取.9DB21/T 36982023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：大连三仪动物药品有限公司、辽宁国托检测有限公司、江苏三仪生物工程有限公司、大连工业大学、彰武县畜牧业发展服务中心。本文件主要起草人：江国托、刘艳、单春乔、李娟、刘秋晨、于洪敏、王岩、赵红秋、翟宏旭、田晶、陈玲、王效禹、宋蕙男、吴怡琦、刘星、冷寒冰。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式
3、进行反馈。我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址：大连三仪动物药品有限公司，辽宁省大连市甘井子区营城子镇营旭路9号，联系电话：0411-66886298。DB21/T 369820231饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测1范围本文件规定了饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测方法。本文件适用于各种饲料添加剂各组分中丁酸梭菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；
4、不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.2 食品微生物学检验菌落总数测定GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699.1 饲料 采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FTGFluid Thioglycollate，液体硫乙醇酸盐5稀释液、培养基及试剂5.10.85%灭菌生理盐水。5.2丁酸梭菌培养基：见附录 A 中的 A.1。5.3革兰氏染色液：见附录 A 中的 A.2。5.4细菌生化鉴定试剂盒。5
5、.5细菌基因组 DNA 提取试剂盒。5.6标准菌株：丁酸梭菌 CICC10390。5.7实验室用水:按照 GB/T 6682 进行。6设备和实验器材DB21/T 3698202326.1恒温培养箱：37 1。6.2漩涡震荡器：02800 rpm。6.3显微镜：1000 倍。6.4高压灭菌锅：105134。6.5无菌玻璃或塑料培养皿=90 mm。6.6无菌锥形瓶 250 mL。6.7无菌玻璃或塑料涂布棒。6.8无菌吸管：1 mL（具 0.1mL 刻度）和 10 mL（具 0.5 mL 刻度）。6.9微生物鉴定仪。6.10电子天平：感量为 0.1 g、0.01 g、0.0001 g。6.114 冰
6、箱。6.12pH 计：精确度 0.1。6.13量筒：250 mL。6.14普通 PCR 仪。6.15电泳仪。6.16凝胶成像仪。6.17移液器：量程 10 L、100 L、1000 L、10000 L。7检验程序丁酸梭菌检验程序见图1。DB21/T 369820233图 1丁酸梭菌检验程序8采样实验室样品真实，具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是无菌器皿。采样后，样品应及时送至微生物检验室进行检测。采样数量和方式按照GB/T 14699.1执行。9试样的制备按照GB/T 20195进行。10操作步骤10.1检样制备与稀释以无菌操作取试样25 g(mL)，注入盛有
7、225 mL 0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，均质1 min2 min或置振荡器中振荡30 min，制成110的初始菌悬液。吸取110的初始菌悬液1 mL，加入9 mL 0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1100的稀释液。根据样品含菌量，按上述操作顺序做进一步的10倍系列递增稀释的稀释度。10.2接种和培养选择2个3个适宜稀释度，每个梯度3个平行，用无菌移液器分别吸取0.1 mL稀释液，接种到改良FTG培养基上，pH 7.00.2。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面，涂布棒不应接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好，室温中放置15 min，使接种物完全
8、被培养基吸收，倒置于37 1 培养箱中厌氧培养24 h1 h。10.3菌落计数及筛选DB21/T 369820234培养后，选取菌落数在30个300个之间的平板计数，若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。培养后的平板内的培养基颜色由粉色变成淡黄色，典型丁酸梭菌菌落形态呈端圆，白色，稍凸，不透明，表面菌落稍有不规则。11确证试验11.1菌种制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于丁酸梭菌改良FTG平板上，37 1 严格厌氧培养24 h1 h，从平板上选取至少5个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确
9、证试验。11.2形态观察自转接平板上挑取典型单菌落，做革兰氏染色镜检。丁酸梭菌为革兰氏阳性菌，显微镜观测菌体呈梭状，有芽孢，芽孢呈椭圆形，中生或近中生。11.3生化确认试验目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验。将挑选纯化的单一菌落，用生化鉴定试剂盒或者生化鉴定管或者微生物鉴定仪按说明进行鉴定试验。丁酸梭菌生化特征见表1。表 1丁酸梭菌生化特征特征结果特征结果乳糖+蜜二糖+水杨苷+松三糖-木糖+棉子糖+山梨醇-鼠李糖-淀粉水解+明胶水解-注：+：阳性；-：阴性。11.4PCR 确证试
10、验11.4.1DNA 提取用商用细菌基因组DNA提取试剂盒或常用提取方法（附录B）提取试样DNA，并设置阴性、阳性对照。11.4.2扩增引物序列上游引物：F 5-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3；DB21/T 369820235下游引物：R 5-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3。PCR反应体系如表2所示。预计扩增产物大小为171 bp。11.4.3PCR 反应PCR反应体系见表2。表 2PCR 反应体系试剂使用量（L）2 Taq Master Mix5上游引物（20 M）0.5下游引物（20 M）0.5模板（100 ng/L）1dd H2O3总体积1011.4.4程序设
11、定程序设定如下：预变性：95 5 min；变性：95 30 s；退火：55 30 s 延伸：72 30 s；保温：4 10 min。步骤至的循环数设为35。11.4.5电泳用电泳缓冲液(1TAE)制备1.0%琼脂糖凝胶，加入Gelred染料。取5L PCR扩增产物，进行点样。用DNA分子量标记物做参照。3 V/cm5 V/cm恒压电泳，电泳30 min，电泳检测结果用凝胶成像仪记录并保存。11.4.6确证结果11.4.6.1当阳性对照孔出现 171 bp 扩增带，阴性对照孔未出现目的条带时,试验结果成立。11.4.6.2被检样品出现 171 bp 扩增带，丁酸梭菌阳性；未出现相应扩增带的样品判
12、为阴性。12结果计算与报告12.1菌落计数只计算符合10.3的菌落。菌落计数后，随机挑取 5 个菌落进行鉴定，根据证实为丁酸梭菌菌落数计算出该皿内的菌数，然后乘其稀释倍数即得每 g（mL）样品中的菌数，按式（1）计算：A=B C5 (1)式中：DB21/T 369820236A 测定的丁酸梭菌菌落数，CFU/g(mL)。B丁酸梭菌的可疑菌落总数。C5个鉴定的菌落中确认为丁酸梭菌的菌落数。f稀释倍数。最终结果按照GB/T 8170数值修约规则修约至整数。示例：含有丁酸梭菌的样品中106稀释液在培养基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为丁酸梭菌的是4个，由1 g饲料中含丁酸
13、梭菌菌数为：100 45 106=8.0 107 CFU/g12.2样品中丁酸梭菌菌数的计算方法与报告选择两个连续稀释度平板（每个稀释度至少有一块平板，其上经确证后的丁酸梭菌数介于30个300个之间），通过式（2）计算，即为1 mL或1 g样品中的丁酸梭菌菌数N：N=1+0.12 (2)式中：N-样品中丁酸梭菌菌落数；a-所有平板经确证后的丁酸梭菌菌数的总和；V-平板的接种体积，单位为毫升（mL）；n1-第一个稀释度的平板数；n2-第二个稀释度的平板数；d-第一个稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的 d 值）。按照GB/T 8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可将样品的丁
14、酸梭菌菌落数记录为1.0-9.9乘以10的指数幂表示。报告每mL或每g样品的丁酸梭菌估计数，单位CFU/g（mL）。示例1：若第一个稀释度（10-4）经确证后的菌落数为137和201，第二个稀释度（10-5）经确证后的菌落数为34和56，则：N=137+201+34+560.1 2+0.12 104=4280.000022=19454545式中：按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中含丁酸梭菌估计数为19454545 CFU/g（mL）或1.9107 CFU/g（mL）。示例2：若只有最后一个稀释液（10-5）经证实含丁酸梭菌菌落数为121和135，则：N=121+1350.1
15、2105=2560.000002=128000000式中：按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中丁酸梭菌估计数为128000000 CFU/g（mL）或1.3108 CFU/g（mL）。DB21/T 369820237AA附录A（规范性）培养基和试剂A.1改良 FTG 培养基A.1.1成分胰蛋白胨15 g酵母粉5 g葡萄糖10 g硫代乙醇酸钠3 gL-半胱氨酸盐酸盐0.5 g氯化钠2.5 g琼脂20 g刃天青0.001 g蒸馏水1000 mLA.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，调pH值至7.00.2，加热煮沸，121 高压灭菌15 min。A.2革兰氏染色A.2.1结晶紫染色
16、液A.2.1.1成分结晶紫1 g95%乙醇20 mL1%草酸铵水溶液80 mLA.2.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.2.2革兰氏碘液A.2.2.1成分碘1 g碘化钾2 g蒸馏水300 mLA.2.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。A.2.3沙黄复染液DB21/T 369820238A.2.3.1成分沙黄0.25 g95%乙醇10 mL蒸馏水90 mLA.2.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.2.4染色法将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1 min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1
17、 min，水洗；滴加95%乙醇脱色，约30 s，水洗；滴加沙黄复染液，复染1 min，水洗，待干，镜检。DB21/T 369820239BB附录B（资料性）细菌 DNA 提取B.1细菌 DNA 提取步骤B.1.1细菌培养细菌接种于5 mL液体培养基中，37 摇床（300 rpm）培养过夜。B.1.2细菌收集取1 mL培养物于1.5 mL无菌EP管中，室温8000 rpm 离心5 min，弃上清，沉淀重新悬浮于1 mL TE（pH 8.0）中或dd H2O中。B.1.3菌体裂解加入6 L 50 mg/mL的溶菌酶，37 作用2 h。再加2 mol/L NaCl 50L，10%SDS 110L，20 mg/mL的蛋白酶K 3L，50 作用3 h或37 过夜（此时菌液应为透明粘稠液体）。B.1.4抽提菌液均分到两个1.5 mL无菌EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置5 min10 min，12000 rpm离心10 min，抽提两次（上清很粘稠，吸取时应小心）。B.1.5沉淀加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min，12000 rpm离心10 min。B.1.6洗涤沉淀用75%的乙醇洗涤。B.1.7稀释抽（凉）干后，溶于50L dd H2O中，取适量作为PCR模板。
