1、ICS 65.150 CCS B 50/59 DB21辽宁省地方标准 DB21/T 36382022 海蜇种质鉴定技术规范 Technical Regulation for Germplasm identification of Rhopilema esculentum2022-10-30 发布2022-11-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布 DB21/T 36382022 I前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及某些专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并
2、归口。本文件起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本文件主要起草人：李云峰、李玉龙、周遵春、鲍相渤、陈百灵、陈井童、田梅琳。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号），联系电话：041184697003。DB21/T 36382022 1海蜇种质鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了海蜇（Rhopilema escu
3、lentum）的学名与分类、鉴定方法和判定规则。本文件适用于海蜇种质检测和鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型分析 3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 学名与分类 学名4.1 海蜇 Rhopilema esculentum（Kishinouye,1891）。分类4.2 刺胞动物门
4、（Cnidaria）、钵水母纲（Scyphomedusae）、根口水母目（Rhizostomeae）、根口水母科（Rhizostomatidae）、海蜇属（Rhopilema）。5 鉴定方法 抽样5.1 按GB/T 18654.2规定执行。形态特征5.2 在自然光下进行观察记录，体形呈蘑菇状，分为伞体部和口腕部，伞体部和口腕部之间，由胃柱、胃膜、口柱连为一体。伞体部表面光滑，呈半球形，伞体部边缘有8个感觉器，将伞缘平分成为8个区，每个区有14个22个缘瓣，呈舌状。生殖下穴外侧的内伞部表面有4个生殖乳突，口柱基部具有8对肩板，每个肩板左右扁平，为三翼形。口腕部具有8条口腕，呈三翼型，口腕上具有丝
5、状附属器和棒状附属器。海蜇外形及纵切面图见图1。DB21/T 36382022 2 图1.海蜇外形及纵切面图 1.中胶层；2.胃腔；3.生殖下穴；4.间辐管；5.肩板；6.口腕管；7.外伞；8.生殖乳突；9.生殖腺；10.胃丝；11.内伞；12.感觉器；13.缘瓣；14.口腕；15.丝状附属器；16.棒状附属器 繁殖5.3 5.3.1 性成熟海蜇雌雄异体，雄性和雌性性成熟年龄为1龄。5.3.2 怀卵量怀卵量随个体的增大而增加，每个雌性海蜇一生的怀卵量为2.0106粒8.0107粒。在显微镜下观察性腺发育情况，当卵子直径在80m100m可进行繁殖，统计每个雌性海蜇的怀卵量。5.3.3 产卵类型海
6、蜇分批产卵，卵为沉性卵，卵径80m100m，产卵2批3批，产卵时间在8月10月。5.3.4 繁殖特性世代交替生殖，水母型通过有性生殖产生无性世代水螅型，水螅型通过横裂生殖产生有性世代水母型。细胞遗传学特性检测5.4 5.4.1 染色体数体细胞染色体数：2n=42。5.4.2 核型染色体组核型公式：10m+14sm+12st+6t，NF=78。染色体核型见图2。DB21/T 36382022 3 图2.染色体核型 5.4.3 染色体标本的制备按照附录A的规定执行。5.4.4 染色体数目及核型分析按照GB/T 18654.12 执行。分子遗传学特征5.5 5.5.1 DNA 提取 取海蜇口腕部20
7、0 mg，用DNA提取试剂盒或CTAB法进行提取。5.5.2 COI 基因的引物序列正向引物(F)：GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G；反向引物(R)：TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA。5.5.3 反应条件PCR反应液见附录B表B.1。反应条件为：94 预变性5 min；进入30个循环，每个循环94 变性30 s，53 56 退火30 s，72 延伸30 s；最后72 延伸5 min。5.5.4 COI 基因序列测序PCR产物纯化后克隆进行测序。COI基因片段序列如下：长度为620 bp ACTGATACACTGATTGACG
8、TACTGACAATCTGATTGTCTGTCGTCTGTCGCTTGCTTGTGCAGCAGCTTATGCAGCAGCTGACACAACACGACCACTGTGAACTTGTACCATCCGTGTGAGGTGGACAGAGCTGCGTGTGTCTGTCCTTGCATGAAGAGCACCTCCCTCGTGTGTCTATCTCTTCGGCCTCACATTGGAGCTATTTTGTTGGTTGTTTTTGCTGCCATTTTTAACACGTTATTATATTATACAAATTGTTGCTDB21/T 36382022 4GCACACGCACCAGAAGAGACGTTCGCTCGTTCGCTCGTT
9、CGTTTGTCTCTTGCTGTATACGTGTGGCTAGCGATAAAACAAAACAAACCAAGAAACAACTTCCAACGGTGGATCTCTTGGCTCGTGCATCGATGAAGAACGCAGCCAGCTGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAACCCAGCGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAATGGCGCTCCTTGGTTCTCCATGGAGCACGTCTGTCTGAGCGTCATGGCCAATCAATCCCAATAGCACACGCTCTTCTGCAAAGAGAGGAGCATGTGGCGTTGAGGCAACACGGCGTTGATGACGGACATCAGC
10、CATCAACTGATGTCTGTC 6 判断规则 符合第5章要求，且COI基因序列测序结果与5.5.4节比对结果相似度在98%以上，判定为该种。DB21/T 36382022 5附 录 A (规范性）染色体标本的制备方法 A.1 秋水仙素处理：将发育至囊胚期的胚胎细胞收集于10ml管内，加入终浓度为0.4g/L的秋水仙素（无菌海水配置）于24 处理45min。A.2 低渗：将细胞悬液于1000rpm/min离心10min，去除上清后加入0.075mol/L的KCl溶液，27 低渗45min。A.3 固定：去上清后，加入-20 冰箱中预冷的现配置的卡诺固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定3次，每
11、次15min，后置于-20 中过夜处理。A.4 解离：-20 中取出已经固定好的细胞悬液，离心去上清，加入预冷的50%冰醋酸1-2滴进行解离后，加入-20 预冷的新配置的卡诺固定液。A.5 滴片：将细胞悬液在距冰冻载玻片上1m左右的高度滴下，酒精灯火焰干燥。A.6 染色：将载玻片置于现配置的10%Giemsa（pH=6.8）染缸内染色30min，用蒸馏水冲洗干净，或将载玻片用DAPI染色，封片，染色24h，-20 保存。A.7 观察：将染色体标本在100倍油镜下检测观察。DB21/T 36382022 6附 录 B (规范性）PCR扩增反应液PCR扩增反应液配方见表B.1。表 B.1 PCR 扩增反应液配方 反应体系 含量 DNA 模板 50 ng100 ng 10X PCR 缓冲液 2.5 L MgCl2(25 mmol/L)2.0 L dNTP(10 mmol/L)0.5 L 引物 F(50 pmol/L)0.5 L 引物 R(50 pmol/L)0.5 L Taq 聚合酶(5U/l)0.2 L 超纯水 18 L _
